木犀草素對喉癌Hep2細胞凋亡的影響

張雪燕，李蕾蕾,石曉麗，霍峻鋒，劉曉潔，秦甜甜，劉衛華，申益維，宋永安，王 淙

1)鄭州大學藥物研究院 鄭州 450001 2)青島大學附屬醫院藥劑科 山東青島 266033 3)鄭州大學人民醫院呼吸內科 鄭州 450003

【基金項目】河南省基礎與前沿技術研究項目(152300410030)；河南省高等學校重點科研項目(18A350013, 14B350011)

【作者簡介】王淙，通信作者，女，1972年10月生，博士，副教授，研究方向：腫瘤藥理，E-mail:wangcong@zzu.edu.cn

Luteolin significantly inhibited Hep2 cells survival in a time- and concentration-dependent manner(P<0.001). Luteolin induced apoptosis and apoptotic bodies were observed in Hep2 cells. Western blot showed that luteolin increased the expressions of Bax and Bid, while reduced the expression of Bcl-2(P<0.001).Conclusion:Luteolin induces apoptosis of Hep2 cells by upregulating Bax and Bid proteins and downregulating Bcl-2 protein.

喉癌是原發于頭頸部的惡性腫瘤，較為常見的是鱗狀細胞癌，占比高達95%。早期喉癌患者的5 a生存率為45%～60%，目前主要采用手術和放射治療，但術后多有發聲障礙[1-2]，影響患者的生活質量。尋找有效的化療藥物是目前治療喉癌的重點。木犀草素是一種來源于天然植物的化合物，多見于芹菜、青椒等蔬菜中，具有多種生物學活性，可以保護神經系統、提高免疫力、清除自由基，臨床多用于抗菌消炎、治療心血管疾病和神經系統疾病等。近年來，研究[3-5]表明木犀草素可以通過EGFR通路抑制乳腺癌細胞的生長；通過CREB1通路抑制結直腸癌細胞的上皮間質化轉變；通過抑制STAT3通路誘導乳腺癌細胞凋亡等。本研究觀察了木犀草素對喉癌Hep2細胞凋亡的影響并探討可能的作用機制，為喉癌藥物的研發提供新的思路。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑木犀草素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，Hep2細胞由鄭州大學藥物研究院保存。細胞培養基RPMI 1640和標準胎牛血清(以色列BI公司)，胰蛋白酶和BCA蛋白定量試劑盒、Hoechst 33258和曲拉通溶液(北京索萊寶公司)，β-actin和羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)，ECL發光液(美國Therom Fisher公司)。磺酰羅丹明B(SRB，大連美侖生物科技公司)，鼠抗人Bax、兔抗人Bcl-2和Bid抗體(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.2細胞培養Hep2細胞用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，于37 ℃、體積分數5%CO2恒溫加濕培養箱中培養。2～3 d傳代1次，每2 d更換培養基。

1.3細胞存活情況檢測收集對數生長期細胞，以2×103個/孔均勻鋪至96孔板，置培養箱中培養過夜。待細胞貼壁后，將200 μL含不同濃度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和32.0、64.0和128.0 μmol/L)木犀草素的培養基加入96孔板中，每個濃度設置3個復孔，并設陰性對照(0.0 μmol/L木犀草素)組。24、48或72 h后，每孔加入150 μL 4 ℃預冷的三氯乙酸溶液，置4 ℃冰箱固定細胞30 min，去離子水沖洗3遍，室溫晾干。每孔加入70 μL體積分數0.4%的SRB染液，染色30 min后棄染液，用體積分數1%的乙酸沖洗4次，室溫晾干，100 μL Tris堿性溶液(pH 10.5)溶解染料，搖床振蕩20 min后，測定560 nm波長下的吸光度(A)值。細胞存活率=實驗孔A值/對照孔A值×100%。

1.4細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染法檢測將Hep2細胞按照4×105個/孔均勻鋪至6孔板，待細胞貼壁后，更換含有不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)木犀草素的培養基，培養箱孵育48 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化、收集細胞；PBS洗滌細胞，加入Binding Buffer懸浮細胞，再分別加入各5 μL的Annexin V-FITC和PI溶液，室溫避光染色15 min，上流式細胞儀檢測。

1.5凋亡小體的Hoechst33258染色收集處于對數生長期的Hep2細胞并計數，以1.5×105個/孔接種于6孔板中，置細胞培養箱中過夜，待細胞貼壁后，加入含0、10、20和40 μmol/L木犀草素的培養基孵育24 h，棄培養基，每孔加入1 mL甲醇30 min。PBS清洗2次，每孔加入1 mL Hoechst 33258和1 μL曲拉通溶液染色30 min。PBS清洗2次，熒光顯微鏡下拍照。

1.6凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和Bid的Western blot檢測Hep2細胞分別用0、10、20、40 μmol/L木犀草素處理24 h，胰蛋白酶消化，收集后PBS清洗2遍，加入裂解液混勻后離心，BCA試劑盒進行蛋白定量。蛋白樣品中加入6×Loading Buffer，100 ℃變性10 min，4 ℃保存備用。SDS-PAGE法分離蛋白質并轉移至硝酸纖維素膜，用TBST(含Tween 20的Tris緩沖鹽，pH 7.8)配制的封閉液室溫下封閉2 h。加入Bax、Bcl-2和Bid一抗(均稀釋1 000倍)4 ℃孵育過夜。洗膜后室溫下加入二抗孵育2 h。膜上加上適量發光液，暗室曝光。用Image J軟件分析，以目的蛋白與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.7統計學處理采用SPSS 20.0分析。不同濃度木犀草素作用不同時間后各組Hep2細胞存活率的比較采用析因設計的方差分析；各組細胞凋亡率和凋亡相關蛋白表達的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1木犀草素對Hep2細胞存活情況的影響木犀草素呈時間和濃度依賴性地抑制Hep2細胞存活(表1)，24 、48 、72 h的IC50分別為49.65、10.93 、 7.97 μmol/L。

表1 不同濃度木犀草素作用不同時間對Hep2細胞存活率的影響(n=3) %

F濃度=2 819.258，F時間=242.012,F交互=210.793，P均<0.001

2.2各組Hep2細胞凋亡率比較結果見表2。

表2 各組Hep2細胞凋亡率比較 %

各指標組間兩兩比較，P均<0.05

2.3各組Hep2細胞凋亡情況0 μmol/L木犀草素組細胞核形態規則，藍色熒光分布均勻，而隨著木犀草素濃度的增加，細胞核內開始出現致密的藍色顆粒狀熒光，形成凋亡小體(圖1)。

2.4各組Hep2細胞中凋亡相關蛋白表達的比較Hep2細胞中促凋亡蛋白Bax、Bid的表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，見圖2、表3。

A、B、C、D：分別為0、10、20、40 μmol/L木犀草素組

1～4：分別為0、10、20、40 μmol/L木犀草素組

表3 各組Hep2細胞中凋亡相關蛋白表達水平的比較

各指標組間兩兩比較，P均<0.05

3 討論

木犀草素屬于天然黃酮類化合物，廣泛存在于水果和蔬菜中。研究[6-10]表明木犀草素具有保護心血管、抗菌、抗炎等作用，且通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、自噬和阻滯細胞周期等達到抑癌效果。細胞凋亡是細胞自主性、程序性的死亡，可以維持細胞內環境的穩定，有利于維持細胞存活和死亡之間的平衡。細胞凋亡分為內源性和外源性細胞凋亡，內源性細胞凋亡由線粒體控制，又稱為線粒體途徑凋亡。Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的重要調控者[11]，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的兩個主要成員[12]，通過形成同源二聚體或者異源二聚體調控細胞凋亡。Bcl-2蛋白或者其同源二聚體占優勢會抑制細胞凋亡；Bax蛋白或者其同源二聚體占優勢則誘導細胞凋亡[13]。Bid蛋白是Bax家族的一員，可誘導細胞凋亡[14]。

該研究結果表明，木犀草素可抑制Hep2細胞的生存，24、48、72 h的IC50分別為49.65、10.93、7.97 μmol/L,因此后續實驗中選用0、10、20、40 μmol/L作為木犀草素的實驗濃度。木犀草素能誘導Hep2細胞凋亡，Hep2細胞早期凋亡率和晚期凋亡率隨木犀草素作用濃度的增大而增加； Hoechst染色實驗結果表明隨著木犀草素濃度的增加，細胞核內開始出現凋亡小體，進一步提示木犀草素可以誘導喉癌細胞的凋亡。本研究的結果亦表明，木犀草素可以濃度依賴性地抑制Hep2細胞的存活，促進Hep2細胞的凋亡，其具體機制與誘導線粒體凋亡途徑凋亡相關蛋白Bax和Bid的表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達有關。

綜上所述，木犀草素通過增加凋亡蛋白表達，抑制抗凋亡蛋白表達來促進Hep2細胞的凋亡，本研究為木犀草素在治療喉癌中的作用提供了參考。