生精障礙患者227例遺傳學分析

李 靜，畢亮亮，黃巖杰，楊曉青，梅曉峰，李金剛，白夢刻

河南中醫藥大學第一附屬醫院兒科實驗室 鄭州 450000

不孕夫婦中男性不育的占比為30%～40%，其中生精障礙(少精、弱精和無精)是導致男性不育和生育力下降的主要原因[1-2]，有10%～15%的男性不育與遺傳因素有關，染色體和Y染色體微缺失是主要的遺傳因素[3]。本研究回顧性地分析了227例生精障礙患者的染色體核型和Y染色體上精子發生調控基因無精子因子(azoospermia factor，AZF)微缺失檢測結果，并結合臨床資料，探討遺傳學檢查在生精障礙患者診斷中的意義。

1 對象與方法

1.1研究對象2011年1月至2017年1月以不育為主訴來河南中醫藥大學第一附屬醫院就診的男性患者，年齡在21～48歲。經臨床和實驗室檢查排除精道梗阻、泌尿生殖道感染、隱睪、精索靜脈曲張等因素引起的生精障礙。其中有227例進行了染色體G顯帶分析和AZF 8個位點檢測。

1.2染色體核型分析用肝素鈉管抽取2 mL外周血，進行外周血淋巴細胞培養。常規進行染色體G顯帶分析，每例計數分析30個核型，疑為嵌合體者加倍分析，必要時增加C顯帶分析，如：qh+、qh-、inv(9)。核型描述參照《人類細胞遺傳學國際命名體制2009》。

1.3AZF微缺失檢測試劑購自北京愛普益生物科技有限公司。以AZF的8個序列標志位點(sequence tagged sites，STS)為靶序列。STS位點包括AZFa sY84、sY86，AZFb sY127、sY134，AZFc sY254、sY255，AZFd sY145、sY152。取EDTA抗凝全血200 μL置于滅菌管中，提取DNA后備檢。PCR反應體系為25 μL，包括Mix 22 μL、反應酶1 μL、DNA模板2 μL，振蕩混勻并放入PCR擴增儀。擴增條件： 95 ℃5 min； 94 ℃20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，4個循環； 94 ℃ 15 s，56 ℃ 1 min，33個循環。反應結束后分析圖像。Baseline的Start值設在3～10、End值設在10～15。sY127、sY134、sY152、sY254、sY255位點無明顯S型擴增曲線或Ct>24判定為缺失，sY84、sY86、sY145位點無明顯S型擴增曲線或Ct>28判定為缺失。

2 結果

2.1染色體核型與AZF微缺失檢測結果227例生精障礙患者中有49例(21.59%)染色體核型異常，其中Kleinefelter綜合征(47,XXY)17例(7.49%)，性反轉(46，XX)2例(0.88%)，Y染色體部分缺失[46,X,del(Y)]2例(0.88%),常染色體易位5例(2.20%)；染色體多態性核型23例(10.13%)。相比于少弱精患者，無精患者染色體異常檢出率最高，并以Y染色體的數目和結構異常最為突出。

AZF微缺失共檢出21例(9.25%)。178例核型為46,XY的生精障礙患者中檢出AZF微缺失10例(5.62%)；12例核型為46,X,Yqh-的患者中檢出AZF微缺失6例(50.00%)；17例核型為47,XXY的患者中檢出AZF微缺失1例(5.88%)；2例核型為46,X,del(Y)和2例核型為46,XX的患者均存在AZF微缺失。具體見表1。

表1 染色體核型與AZF微缺失結果

2.2AZF微缺失STS結果59例少精患者中發生AZF微缺失4例(6.78%),94例弱精患者中發生AZF微缺失8例(8.51%)；74例無精患者中發生AZF微缺失9例(12.16%)。缺失區域分布見表2。

表2 AZF微缺失結果

2.3 1例染色體核型異常合并AZF微缺失病例的測序驗證結果患者臨床表現為身高145 cm，有喉結和胡須，無精癥。外周血核型結果為46,X,del(Y)(q11.23)(圖1)。AZF微缺失結果為AZFa、AZFb、AZFc、AZFd均無擴增。應用測序技術對該患者的外周血進行染色體拷貝數變異檢測，發現Y染色體p11.2→q11區段存在19.1 Mb缺失，del(Y)( p11.2→q11)(9649248→28800000)(圖2)。

核型：46,X,del(Y)(q11.23)

紅色表示4倍重復，黃色表示3倍重復，綠色表示2倍正常，藍色表示1倍缺失

圖2染色體拷貝數變異檢測圖譜

3 討論

近年來由于生活壓力的增加、環境污染等原因，不孕不育夫婦逐年增多，其中男性不育顯著增加。約90%的不育男性存在精子發生障礙，臨床表現為少精、弱精甚至無精癥。精子生成過程受激素、環境、遺傳等多種因素的影響[2,4]。據統計，男性不育患者中有2.2%～33.0%存在染色體異常，約10%存在Y染色體微缺失[5-7]。

Y染色體上有負責睪丸發育和精子生成的基因，還存在大量重復序列和回文結構。由于回文結構易于丟失，內部基因的丟失導致精子生成障礙和不育。Y染色體的數目或結構異常是導致男性不育的主要原因。本研究227例生精障礙患者中性染色體異常38例，包括17例47,XXY、2例46,XX、2例46,X,del(Y)、17例Y染色體多態性核型，其中47,XXY是導致無精癥最常見的核型。Y染色體缺失也是導致男性生精障礙的原因之一。本研究檢出2例46,X,del(Y)，對其中1例進行染色體拷貝數變異檢測，發現Y染色體存在19.1 Mb缺失，其臨床表現為個矮及無精癥。常染色體易位也導致嚴重的生精障礙，可能是由于精子發生的關鍵基因受到破壞或者在減數分裂期間干擾染色體分離[8-9]。本研究中檢出5例常染色體易位，其臨床表現為少精和弱精。

有文獻[10-11]報道染色體多態性與不良孕產史、精子數目和形態發育異常相關，因影響減數分裂過程而導致男性不育，染色體多態性在男性不育人群中的發生率為12.2%～38.0%，遠高于正常人群中的3.96%。本研究227例生精障礙患者中共檢出染色體多態性23例(10.13%)，與上述文獻報道接近。目前染色體多態性與男性不育的相關性存在爭議，盡管有文獻[12]報道Y染色體多態性與不育無相關性，但Y染色體的長度是對男性生育功能影響最顯著的一種多態性，而且具有遺傳效應。本研究檢出Y染色體多態性17例(7.49%)，臨床表現為少精、弱精和無精。其中12例核型為Yqh-患者檢出AZF微缺失6例(50.00%)，因此對于核型為Yqh-的患者，應進一步檢測AZF微缺失，必要時應進行染色體拷貝數變異檢測。如果存在AZF微缺失，建議通過胚胎植入前遺傳學診斷(preimplantation geneticdiagnosis，PGD)選擇女性后代，以免與將同樣的微缺失遺傳給后代。inv(9)檢出5例(2.20%)，臨床表現為少精、弱精和無精，與文獻[10]報道的9號染色體多態性會影響精子的生成發育一致。

有研究[8,13]表明，AZF位于Y染色體長臂q11.23，該區域的缺失與男性生精障礙密切相關。AZF微缺失存在明顯種族和地域的差異，目前我國不同地區報道的AZF微缺失均有差異：東北地區1 738例不育男性中AZF微缺失檢出率為8.57%[14]，甘肅地區373例不育男性中AZF微缺失檢出率為11.3%[15]。本研究227例生精障礙患者AZF微缺失檢出率為9.25%，主要見于47,XXY、46,XX、46,X,del(Y)、46,X,Yqh-的異常核型患者中；但在178例核型正常的男性生精障礙患者中AZF微缺失10例(5.62%)，提示染色體核型正常的男性生精障礙患者也應進行AZF微缺失檢測。

AZF包括AZFa、AZFb、AZFc、AZFd 4個區域，不同區域的缺失導致精子質量不同程度的降低，甚至無精。AZFa包含USP9Y、DBY和UTY等基因，缺失可導致生精障礙和睪丸發育異常。AZFa缺失概率較低(1%～5%)，但臨床癥狀較嚴重[16]。本研究檢出1例AZFa缺失，臨床表現為無精。AZFb包含KDM5D、KDM5D、RPS4Y2和CYORF15等基因，與精子的發生過程有關。AZFb缺失導致生精阻滯，停留在精母細胞和精子細胞階段[16]。本研究AZFb缺失檢出2例，臨床表現為少精或無精。AZFc是Yq上最活躍的區域，包括DAZ、BPY2和CDY等基因，在男性不育中起重要作用[9,16]。本研究檢出AZFc缺失7例，臨床表現多為弱精和無精。AZFd位于AZFb和AZFc之間，與AZFc序列重疊，所以AZFd缺失臨床表現類似AZFc[9]。本研究檢出AZFd缺失4例，臨床表現為少精和弱精。多區域同時缺失7例，臨床表現為弱精和無精。

綜上所述，染色體核型異常和(或)AZF微缺失可影響男性精子質量而導致不育，因此男性生精障礙患者進行染色體核型分析并聯合AZF微缺失檢查有助于精確診斷和指導治療。