不同生態(tài)因子對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

蓋春蕾，許 拉 ，樊 英，于曉清，葉海斌，王 西，曹海鵬

( 1.山東省海洋生物研究院，山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266002； 2.上海海洋大學(xué)，國家水生動(dòng)物病原庫，上海 201306 )

鹵蟲(Artemia)無節(jié)幼體卵黃含有較多蛋白質(zhì)和脂肪，是水產(chǎn)育苗過程中必不可少的生物餌料，占育苗成本的50%～70%，深受蝦苗場的重視[1]。近年來，我國在鹵蟲的繁殖、鹵蟲卵的孵化技術(shù)及其作為生物餌料對養(yǎng)殖動(dòng)物的應(yīng)用研究方面做了大量的工作[2-9]。然而，鹵蟲卵孵化出無節(jié)幼體過程中，其孵化水體(暫名：鹵蟲卵孵化水體)中易滋生大量弧菌(Vibrio)，導(dǎo)致鹵蟲無節(jié)幼體受弧菌污染問題越來越突出，嚴(yán)重影響了作為水產(chǎn)種苗生物餌料的鹵蟲質(zhì)量，而影響鹵蟲卵孵化的鹽度、pH、孵化密度等一些重要生態(tài)因子[10]對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響卻鮮有報(bào)道，這極大地阻礙了優(yōu)質(zhì)鹵蟲的生產(chǎn)進(jìn)程。鑒此，本試驗(yàn)觀察了脫殼時(shí)間、鹽度、pH、抑菌微生物制劑、孵化密度等生態(tài)因子對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響，以期為優(yōu)質(zhì)鹵蟲的培育奠定重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鹵蟲卵(無棣海吉水產(chǎn)有限公司)；漂白液(江西草珊瑚消毒用品有限公司)；硫代硫酸鈉溶液，有效含量為2%(上海傲之珊實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板(上海綠奧生物科技有限公司)；碳酸鈉[國藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑有限公司]；抑菌微生物制劑，主要成為為復(fù)合抑菌微生物(上海綠奧生物科技有限公司)；海水晶(浙江藍(lán)海星制品有限公司)；根據(jù)海水晶說明書配制的鹽度為15、20、25、30、35的人工海水，均于121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.2 脫殼液的配制

參照文獻(xiàn)[5]的方法配制。即425 g干蟲卵對應(yīng)的脫殼液組成為漂白液1700 mL、氫氧化鈉30 g、水3400 mL。具體配制用量根據(jù)鹵蟲卵的質(zhì)量計(jì)算。

1.3 脫殼時(shí)間對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

參照文獻(xiàn)[11]建議的1 g/L孵化密度將鹵蟲卵在脫殼液中進(jìn)行脫殼處理5、10、15、20、25 min，接著用硫代硫酸鈉溶液去除余氯，然后將鹵蟲脫殼卵放入鹽度20、pH 8.0的人工海水中，置于30 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱并利用小型增氧機(jī)進(jìn)行恒溫增氧孵化，孵化24 h后，檢測鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度?；【芏鹊臋z測方法采用稀釋涂布硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板法。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.4 鹽度對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

參照文獻(xiàn)[11]建議的1 g/L孵化密度將鹵蟲卵在脫殼液中進(jìn)行脫殼處理10 min，接著用硫代硫酸鈉溶液去除余氯，然后將鹵蟲脫殼卵放入鹽度分別為15、20、25、30、35，pH為8.0的人工海水中，置于30 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱并利用小型增氧機(jī)進(jìn)行恒溫增氧孵化，孵化24 h后，檢測鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度?；【芏鹊臋z測方法采用稀釋涂布硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板法。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.5 pH對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

參照文獻(xiàn)[11]建議的1 g/L孵化密度將鹵蟲卵在脫殼液中進(jìn)行脫殼處理10 min，接著用硫代硫酸鈉溶液去除余氯，然后將鹵蟲脫殼卵放入鹽度為20，pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的人工海水中，置于30 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中，用小型增氧機(jī)進(jìn)行恒溫增氧孵化，孵化24 h后，檢測鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度?；【芏鹊臋z測方法采用稀釋涂布硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板法。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.6 抑菌微生物制劑對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

參照文獻(xiàn)[11]建議的1 g/L孵化密度將鹵蟲卵在脫殼液中進(jìn)行脫殼處理10 min，接著用硫代硫酸鈉溶液去除余氯，然后將鹵蟲脫殼卵放入鹽度為20，終質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的抑菌微生物制劑，pH為8.0的人工海水中，置于30 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱并利用小型增氧機(jī)進(jìn)行恒溫增氧孵化，在孵化24 h后檢測鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度?；【芏鹊臋z測方法采用稀釋涂布硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板法。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.7 孵化密度對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

將孵化密度分別0.25、0.5、1、2、4 g/L的鹵蟲卵在脫殼液中進(jìn)行脫殼處理10 min，隨后用硫代硫酸鈉溶液去除余氯，然后將鹵蟲脫殼卵放入鹽度20、pH 8.0的人工海水中，置于30 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱并利用小型增氧機(jī)進(jìn)行恒溫增氧孵化，孵化24 h后，檢測鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度?；【芏鹊臋z測方法采用稀釋涂布硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板法。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan′s檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 脫殼時(shí)間對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

脫殼處理10 min時(shí)，鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度最低(3.4×104cfu/mL)，分別較在脫殼處理5、15、20、25 min后的鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度減少22.87%(P>0.05)、79.56%(P<0.05)、73.94%(P<0.05)和65.50%(P>0.05)(圖1)。因此，脫殼處理10 min更有利于減少鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度。

圖1 脫殼時(shí)間對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響圖中小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05).下同.

2.2 鹽度對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

鹽度為35時(shí)，鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度最低(5.6×104cfu/mL)，分別較鹽度為15、20、25、30時(shí)的鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度減少69.89%(P<0.05)、93.92%(P<0.05)、94.97%(P<0.05)和6.47%(P>0.05)(圖2)。因此，鹽度為35時(shí)有利于減少鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度。

2.3 pH對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

pH為9.0時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度最低(7.5×103cfu/mL)，分別較pH為7.0、7.5、8.0、8.5時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度減少46.43%(P>0.05)、39.02%(P>0.05)、98.12%(P<0.05)和93.12%(P<0.05)(圖3)。因此，pH為9.0時(shí)更有利于減少鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度。

圖2 鹽度對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

圖3 pH對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

2.4 抑菌微生物制劑對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

抑菌微生物制劑使用時(shí)，鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度顯著降低。抑菌微生物制劑在用量為0.2～1.0 mg/L時(shí)，鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度較對照組減少70.12%～74.27%(P<0.05)(圖4)。其中，抑菌微生物制劑用量為1.0 mg/L時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度最低(4.5×104cfu/mL)，分別較用量為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度減少2.83%(P>0.05)、9.42%(P>0.05)、13.87%(P>0.05)和1.54%(P>0.05)。因此，抑菌微生物制劑的使用有利于減少鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度。

2.5 孵化密度對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

試驗(yàn)結(jié)果見圖5。孵化密度為0.25 g/L時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度最低(1.2×104cfu/mL)，分別較孵化密度為0.50、1、2、4 g/L時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度減少32.79%(P>0.05)、96.42%(P<0.05)、95.55%(P<0.05)和99.12%(P<0.05)。因此，孵化密度為0.25 g/L更有利于減少鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度。

圖4 抑菌微生物制劑對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

圖5 孵化密度對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

3 討 論

鹵蟲卵孵化出的無節(jié)幼體應(yīng)用于水產(chǎn)育苗已經(jīng)納入了我國水產(chǎn)育苗技術(shù)規(guī)范(GB/T 30890—2014)，但有報(bào)道指出，鹵蟲卵孵化過程中的弧菌滋生增加了水產(chǎn)種苗弧菌污染的風(fēng)險(xiǎn)[12]。因此，鹵蟲卵孵化水體中弧菌滋生對鹵蟲無節(jié)幼體的污染問題必須予以重視。這是國內(nèi)首次報(bào)道不同生態(tài)因子對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響，本研究對優(yōu)質(zhì)鹵蟲的培育、減少弧菌對鹵蟲的污染具有指導(dǎo)意義。

3.1 脫殼時(shí)間

脫殼是鹵蟲卵孵化的重要步驟。由于脫殼卵較不脫殼卵具有更高的孵化率，所以生產(chǎn)上通常對鹵蟲卵進(jìn)行脫殼處理。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹵蟲卵在脫殼時(shí)間為10 min時(shí)其孵化水體中弧菌密度最低，但水體中弧菌密度的變化未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，尤其是脫殼時(shí)間在15～25 min時(shí)，水體中弧菌密度反而增加。究其原因，可能是因?yàn)槊摎r(shí)間延長會(huì)導(dǎo)致死卵增多，死卵含有豐富的蛋白質(zhì)，其腐化分解進(jìn)而導(dǎo)致孵化過程中水體弧菌滋生。研究表明，鹵蟲卵在脫殼時(shí)間為10 min和15 min時(shí)孵化率較高[11]。因此，為了生產(chǎn)上既要達(dá)到高孵化率，同時(shí)又要減少鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度，建議脫殼時(shí)間選取10 min。

3.2 鹽度、pH

鹵蟲脫殼卵在不同鹽度的水體中的孵化率不同。廖永巖等[11]認(rèn)為，鹵蟲卵可以通過改變自身的代謝狀況適應(yīng)不同鹽度的水體，并指出，鹵蟲脫殼卵在鹽度為35時(shí)孵化率最高。此外，pH對鹵蟲卵孵化也具有重要的影響。一般情況下，鹵蟲卵在孵化時(shí)，對孵化用水的pH要求在7.5～11.0，最佳pH為8.5～11.0[13-14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在鹽度為35、pH為9的鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度最低。因此，考慮到生產(chǎn)上既要達(dá)到高孵化率，同時(shí)又要盡量減少鹵蟲卵孵化水體中弧菌的污染，建議孵化用水的鹽度選取35、pH選取9。

3.3 抑菌微生物制劑

鹵蟲對水產(chǎn)用化學(xué)殺菌劑極其敏感。薛俊增等[15]研究表明，硫酸鋅、硫酸銅對鹵蟲的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.55、0.05 mg/L。因此，生產(chǎn)上一般不采用化學(xué)殺菌劑處理鹵蟲卵孵化水體中的弧菌，這也是本試驗(yàn)選取安全無毒的抑菌微生物制劑對鹵蟲卵孵化水體中弧菌進(jìn)行處理的原因。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，抑菌微生物制劑在用量為0.2～1.0 mg/L時(shí)，使鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度降低了70.12%～74.27%。根據(jù)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《漁藥臨床試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》中關(guān)于養(yǎng)殖環(huán)境改良劑效果評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[16]，能使主要指標(biāo)改善50%以上為顯效，10%～40%為有效，10%以下為無效，說明抑菌微生物制劑對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的控制效果為顯效?？紤]到生產(chǎn)上抑菌微生物制劑的使用成本，建議用量為0.2 mg/L。

3.4 孵化密度

鹵蟲卵在生產(chǎn)上的孵化都是在高密度下進(jìn)行的[17]，但高孵化密度并不一定產(chǎn)生高孵化率。趙乃剛[18]觀察了不同孵化密度(0.1～2 g/L)對鹵蟲卵孵化率的影響，結(jié)果表明，以0.1 g/L時(shí)的孵化率最高，說明孵化密度低更有利于提高鹵蟲卵的孵化率。此外，在鹵蟲卵孵化過程中空氣等介質(zhì)向鹵蟲卵孵化水體中引入了大量弧菌[19]。由于鹵蟲卵含有豐富的蛋白質(zhì)[20]，鹵蟲卵殼也是一種含鐵脂蛋白，含有58.91%蛋白質(zhì)和多種無機(jī)元素[21]，鹵蟲卵在孵化過程中因孵化密度高導(dǎo)致出現(xiàn)大量死卵與積累的鹵蟲卵殼，這無疑為弧菌滋生提供了豐富的營養(yǎng)，極易使弧菌在條件適宜的孵化水體中快速繁殖起來。因此，應(yīng)該考慮孵化密度對鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在孵化密度最小(0.25 g/L)時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度最低，再加上孵化密度低更有利于提高鹵蟲卵的孵化率[18]，故為了提高孵化率，減少鹵蟲卵孵化水體中的弧菌污染，建議生產(chǎn)上選擇低孵化密度。