丹參活性成分靶點分子網絡的生物信息學預測

張 牧，易朝輝，楊紅梅，宋新強, 代二琴，李開鳴，劉迎福

1)信陽師范學院醫院 河南信陽 464000 2)信陽職業技術學院心理咨詢室 河南信陽 464000 3)北京體育大學學術期刊社 北京 100084 4)信陽師范學院生命科學學院 河南信陽 464000 5)廈門大學醫學院基礎醫學系 福建廈門 361005

心血管疾病是全球主要健康負擔,也是世界上最常見的死亡原因[1-3]。丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)是著名的中藥，通常被用作血液流變劑來改善血液循環，消除末梢血液淤積[4-6]。許多丹參處方中除了丹參，還包含其他中藥，已經被中國食藥監局批準并在臨床廣泛使用，包括丹參膠囊、丹參丸、復方丹參滴丸、丹參酮膠囊等。目前已經從丹參中分離出超過100種生物活性化合物，這些物質通常分為水溶性成分(如丹酚酸、紫草酸B)和脂溶性成分(主要為丹參酮，如丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮ⅡB)。所有這些化合物已經被應用于治療心血管疾病[7-9]。雖然丹參在我國廣泛應用，但其作用機制仍未被充分了解。本研究通過整合生物信息學方法預測丹參發揮作用的信號通路和靶點，并利用在線分析軟件IPA(ingenuity pathway analysis)構建交互作用分子網絡，以期明確丹參活性成分可能的作用靶點和信號通路，探索更詳細的有關作用機制的信息。

1 材料與方法

1.1心血管疾病相關基因的搜索在美國國立生物技術信息中心(NCBI)基因數據庫中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene，截止到2017年4月28日)以“心血管疾病”為搜索條目搜索與心血管疾病相關的基因。搜索結果經過過濾，只保留與人類相關的基因。

1.2丹參靶標蛋白的搜索在小分子PubChem數據庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov，截止到2017年4月28日)的生化實驗數據庫(PubChem BioAssay)、化合物化學結構信息數據庫(PubChem Compound)、機構和個人上傳的化合物原始數據庫(PubChem Substance)中搜索丹參活性成分的靶標蛋白。丹參活性成分包括丹酚酮ⅡA(CID：164676)，丹參酸 B (CID：6451084)，原兒茶醛(CID：8768)，丹參素(CID：11600642)，丹參酮(CID：160254)，三七皂苷R1(CID：441934)，人參皂苷Rg1(CID:441923)，三七皂苷Rb1(CID:122389845)和龍腦(CID:64685)。通過過濾只保留與人類有關的蛋白質。

1.3丹參靶標蛋白交互作用分子網絡的預測基于1.1和1.2搜索結果，利用IPA (www.ingenuity.com)，根據這些分子的功能，通過通路分析，建立丹參靶標蛋白交互作用分子網絡。不同形狀節點代表功能不同的分子，節點之間的聯系至少有一個在文獻、教科書或數據庫中得到支持。由IPA生成分子網絡，采用IPA中的“比較”模塊，基于Fisher精確概率計算，分析分子與信號通路之間的關聯性。最后，通過比較兩個網絡確定丹參在心血管疾病中最有可能的靶點。分析流程見圖1。

圖1 生物信息學分析流程圖

2 結果

2.1心血管疾病相關的基因網絡及其功能共搜索到與心血管疾病相關的基因419條，利用IPA將這些基因編碼的蛋白質組裝成25組網絡(圖2)。這些基因主要涉及LXR/RXR活化、動脈粥樣硬化信號傳導、肝纖維化/肝星狀細胞活化、急性反應期信號傳導、FXR/RXR活化等。

2.2丹參靶標蛋白分子網絡及其功能從PubChem數據庫鑒定出99個丹參靶標蛋白，將它們的基因信息標識符號(GI)導入IPA生成蛋白質-蛋白質交互作用網絡。結果顯示，丹參靶標蛋白主要涉及JAK2信號通路、芳香烴受體信號傳導通路、細胞毒性T淋巴細胞介導的靶細胞凋亡通路、JAK/STAT信號傳導通路等(圖2)。

2.3丹參治療心血管疾病網絡的預測對上述兩組信號通路進行交叉網絡方法預測，共有33個信號通路在心血管疾病相關信號通路和丹參靶標蛋白信號通路中重疊。這些重疊通路主要涉及LXR/RXR活化、動脈粥樣硬化信號傳導、肝纖維化/肝星狀細胞活化、急性反應期信號傳導、FXR/RXR活化等(圖3)。25個網絡與心血管疾病相關，丹參靶點網絡有9個，兩組共享9個網絡；這些網絡主要涉及細胞運動、免疫細胞運輸、血液系統發育、心血管疾病，參與DNA復制、重組、修復等，如圖4。

2.4心血管疾病中丹參特異靶標蛋白的預測丹參作用的、與心血管疾病相關的靶標蛋白參與了幾個關鍵通路。我們從IPA類別中篩選兩個與心血管疾病和丹參靶標蛋白相關的通路，即LXR/RXR活化和動脈粥樣硬化信號傳導通路。這些通路中的幾個節點成為心血管疾病中丹參作用的直接靶點，包括FASN、 PAFAH1B2、PLA2G7、PAFAH1B3 和 IL-1β(圖5)。

圖2 心血管疾病相關基因(左)及丹參靶標蛋白(右)涉及的信號通路

圖3 心血管疾病和丹參靶標蛋白共同涉及的信號通路

左：網絡主要涉及細胞運動、免疫細胞運輸、血液系統發育、DNA的復制重組和修復等；右：網絡主要涉及脂代謝、小分子生物化學、血液系統發育等

圖4兩個心血管疾病和丹參靶標蛋白共享的分子網絡

圖5 LXR/RXR 活化(左)和動脈粥樣硬化(右)信號傳導通路的示意圖(深灰代表丹參靶點)

3 討論

我們利用開放的與心血管疾病基因數據庫和已知或預測丹參作用的蛋白質或蛋白質片段數據庫，通過整合生物信息學分析方法，確定了一些與心血管疾病有關并受丹參調控的信號傳導通路和網絡，并且預測出與心血管疾病相關的幾個丹參作用的特異蛋白質靶點，這為更詳細的機制研究提供了參考。

我們的網絡分析結果提示，丹參治療心血管疾病的機制可能涉及細胞運動、免疫細胞運輸、血液系統發育，DNA的復制、重組和修復等。研究結果與體內外若干研究的一致性提示丹參活性成分發揮心血管保護效應可能是通過清除自由基和超氧陰離子自由基，抑制血管平滑肌細胞的炎癥反應、氧化反應、血栓形成和增殖[10-15]而實現的。丹參活性成分也可能有抑制血管內皮細胞和白細胞中黏連分子的表達，減輕急性心肌缺血損傷[16-18]的作用。

IPA分析結果顯示，丹參可以通過調控LXR/RXR活化、動脈粥樣硬化、肝纖維化/肝星形細胞活化、急性反應期信號、FXR/RXR 活化等信號傳導通路，減輕心血管疾病。同時也鑒定出FASN、PAFAH1B2、PLA2G7、PAFAH1B3和IL-1β是丹參抗心血管疾病的作用靶點。已有研究[19]顯示，丹參能夠抑制炎性細胞因子IL-1β mRNA和蛋白的表達。目前鑒定出的其他幾個靶點未曾有文獻報道。

綜上所述，我們認為利用整合生物信息學分析方法篩選丹參治療心血管疾病涉及的信號通路和靶蛋白是一個很有創意的方法，這種方法適合探索生物活性分子的作用機制。