NF-κB對A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程的影響

周 舫，張 愷，翟若南，薛 騰，任亞南，史鳳顯，馬銘澤，王 航

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室 鄭州 450001

肺癌是中國乃至世界范圍內(nèi)重大的公共衛(wèi)生問題，肺癌患者死亡率高的主要原因之一是肺癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，這也是肺癌臨床治療上的重、難點(diǎn)問題[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)在肺癌的原發(fā)性浸潤和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，經(jīng)歷EMT進(jìn)程的肺上皮細(xì)胞由上皮細(xì)胞立方樣形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞紡錘樣形態(tài)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞骨架重建，細(xì)胞失去極性并產(chǎn)生偽足使細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)[2]，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白Vimentin、N-cadherin的表達(dá)上升，而上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E-cadherin的表達(dá)下降。

近來有研究[3-4]發(fā)現(xiàn)在發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺癌組織中非吞噬細(xì)胞氧化酶4(non-phagocytic cell oxidase 4，NOX4)高表達(dá)；此外NOX4也是哺乳動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的主要來源。研究[5-6]表明ROS在轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，TGF-β的刺激可使細(xì)胞內(nèi)ROS的水平升高，而ROS在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中對包括Smads、MAPK等在內(nèi)的多條細(xì)胞信號通路具有調(diào)節(jié)作用，影響癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。因此，本研究利用TGF-β誘導(dǎo)A549細(xì)胞的EMT進(jìn)程，然后用BAY11-7082特異性地抑制NF-κB的表達(dá)，觀察A549細(xì)胞NOX4、ROS水平，EMT進(jìn)程以及細(xì)胞遷移能力的變化，從而為控制肺癌轉(zhuǎn)移提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料A549細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物研究所。BCA蛋白濃度測定試劑盒、RPMI 1640培養(yǎng)基、NF-κB抑制劑BAY11-7082、二甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶生物科技有限公司，胎牛血清購自美國GEMINI公司，TGF-β購自美國Peprotech公司，NF-κB(p65)、磷酸化NF-κB(p65)[p-NF-κB(p65)]、Vimentin抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，NOX4、Snail、GAPDH、E-cadherin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。ECLIPSE TS100-F倒置顯微鏡(日本尼康公司)，Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，SUNRISE自動(dòng)酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司)，DYCZ-24DN電泳儀(北京六一儀器廠)，凝膠成像儀(美國Bio-Red公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)使用含有青鏈霉素雙抗和體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基復(fù)蘇、培養(yǎng)A549細(xì)胞；培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、相對濕度95%。

1.3實(shí)驗(yàn)分組A549細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右時(shí)，對細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理(使用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h)，然后分為空白組、TGF-β組(5.0 μg/L TGF-β)、TGF-β+BAY11-7082組、BAY11-7082組和溶劑(DMSO)對照組。BAY11-7082工作濃度為20 mmol/L，以DMSO為溶劑。處理24 h后，進(jìn)行以下檢測。

1.4EMT相關(guān)蛋白及NF-κB(p65)、NOX4蛋白表達(dá)的檢測收集細(xì)胞并提取總蛋白，測定蛋白濃度后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔蛋白的上樣量為25 μg。電泳結(jié)束轉(zhuǎn)膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加一抗[NF-κB(p65)和p-NF-κB(p65)抗體按1∶1 000稀釋，Vimentin、E-cadhein、Snail抗體均按1∶2 000稀釋，NOX4抗體按1∶500稀釋，GAPDH抗體按1∶5 000稀釋]，4 ℃孵育過夜，加二抗(按1∶5 000稀釋)，孵育1 h，洗脫3次后加入適量ECL發(fā)光液曝光顯影，結(jié)果使用Quantity One軟件進(jìn)行定量分析。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5ROS檢測利用DCFH-DA探針檢測各組細(xì)胞的ROS水平，采用流式細(xì)胞儀檢測熒光信號的強(qiáng)度，用以反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6劃痕實(shí)驗(yàn)取處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于6孔板，使用無菌的200 μL槍頭在6孔板中心劃一個(gè)“十”字形的劃痕，然后用PBS清洗，再按照1.3中分組對細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理，培養(yǎng)24 h后觀察劃痕寬度的變化，并使用相應(yīng)圖像處理軟件分析劃痕寬度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析比較多組間NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)、EMT相關(guān)蛋白、NOX4蛋白的表達(dá)水平以及細(xì)胞內(nèi)ROS水平的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 5組細(xì)胞NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)、NOX4、ROS水平及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較如圖1和表1、2所示，與空白組比較，TGF-β組E-cadherin蛋白的表達(dá)水平降低，同時(shí)Vimentin、Snail、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)、NOX4蛋白的表達(dá)水平和ROS的水平升高；與TGF-β組相比，TGF-β+BAY11-7082組E-cadherin蛋白的表達(dá)升高，同時(shí)Vimentin、Snail、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)、NOX4蛋白的表達(dá)水平和ROS的水平降低，提示BAY11-7082與TGF-β聯(lián)用存在著拮抗作用。

1～5：分別為空白組、TGF-β組、TGF-β+BAY11-7082組、BAY11-7082組和溶劑對照組

圖1 5組細(xì)胞NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)、NOX4及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

表1 5組細(xì)胞NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

*：與空白組相比，P<0.001；#：與TGF-β組相比，P<0.001；△：與TGF-β+BAY11-7082組相比，P<0.001

2.2 5組細(xì)胞遷移能力比較如表2所示，與空白組相比，TGF-β組劃痕寬度變小，說明TGF-β使細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)；而與TGF-β組相比，TGF-β+BAY11-7082組劃痕寬度增大，說明BAY11-7082抑制NF-κB(p65)降低了細(xì)胞的遷移能力。

表2 5組細(xì)胞NOX4蛋白表達(dá)水平、ROS水平及劃痕寬度的比較(n=3)

*：與空白組相比，P<0.001；#：與TGF-β組相比，P<0.001；△：與TGF-β+BAY11-7082組相比，P<0.001

3 討論

肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，而肺癌易于向骨、腦以及腎臟等部位轉(zhuǎn)移，是造成肺癌患者高死亡率的主要原因之一；在肺癌轉(zhuǎn)移過程中往往伴隨著EMT進(jìn)程的發(fā)生[7]；而研究[8]表明NF-κB可通過調(diào)節(jié)Snail轉(zhuǎn)錄因子的活化從而對EMT進(jìn)程產(chǎn)生調(diào)控作用。

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)并參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，同時(shí)NF-κB信號通路的持續(xù)激活與許多惡性腫瘤的發(fā)生以及侵襲轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)在TGF-β的誘導(dǎo)下檢測到NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)的水平升高，同時(shí)A549細(xì)胞發(fā)生EMT進(jìn)程，具體表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)下降，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白Vimentin的表達(dá)上升，而使用NF-κB抑制劑BAY11-7082特異性地降低NF-κB(p65)的表達(dá)后，E-cadherin蛋白的表達(dá)升高，而Vimentin、Snail蛋白的表達(dá)下降，提示TGF-β誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程受抑，同時(shí)造成NOX4蛋白表達(dá)下降以及ROS的水平降低。有研究[10-11]表明，ROS作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使可以通過影響蛋白的磷酸化過程調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多條信號通路，比如NOX/ROS/MAPK信號通路、PI3K/Akt/mTOR信號通路等，從而影響Smad、Snail等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而對EMT進(jìn)程產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果顯示抑制NF-κB(p65)的表達(dá)可使NOX4來源的ROS的水平降低，低水平的ROS不足以激活相關(guān)的信號通路，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子Snail蛋白的表達(dá)下降，EMT進(jìn)程被抑制。相似的，在乳腺上皮細(xì)胞中，高水平的ROS誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程同樣受到NF-κB的調(diào)控[12]。而在人惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞和U87細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，沉默趨化因子受體7(chemokine receptor 7, CCR7)或者用CCR7的中和抗體處理細(xì)胞后，可抑制NF-κB的活化，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)受到抑制，最終對細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移以及EMT進(jìn)程產(chǎn)生影響[13]。另有研究[14]顯示，下調(diào)CDX2可誘導(dǎo)EMT發(fā)生，從而增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力，提示EMT與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中使用BAY11-7082抑制NF-κB(p65)的表達(dá)后造成細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低，抑制了A549細(xì)胞的EMT進(jìn)程，使細(xì)胞遷移能力下降，和上述研究的結(jié)果相符。因此，由以上結(jié)果可以推斷出：NF-κB對TGF-β誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT進(jìn)程具有調(diào)節(jié)作用，即TGF-β的刺激使NF-κB(p65)活化，細(xì)胞內(nèi)NOX4、ROS水平升高，進(jìn)而激活ROS/Snail等信號通路促進(jìn)細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

綜上所述，在A549細(xì)胞中，NF-κB介導(dǎo)由TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生的EMT進(jìn)程，而抑制NF-κB的活化可抑制NOX4的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的水平下降。低水平的ROS不能充分激活ROS/Snail等信號通路，從而抑制了A549細(xì)胞的EMT進(jìn)程并降低細(xì)胞的遷移能力。