NF1和p-ERK1/2蛋白在苯并芘聯合脂多糖誘導的小鼠肺癌中的表達

邵 華，張 怡，黃 麗，高 敏，馮斐斐

鄭州大學公共衛生學院衛生毒理學教研室 鄭州 450001

肺癌已成為世界上發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，由于當前肺癌的早期診斷率和遠期療效仍不夠理想，故對肺癌的診治手段還需做更多的研究和探索[1]。有研究[2]表明，神經纖維瘤蛋白1(neurofibromatosis 1,NF1)可以將活性的RAS-GTP復合物轉換為非活性的RAS-GDP，NF1表達水平的降低導致RAS信號通路的持續激活，進而刺激細胞生長、增殖。此外NF1缺失還可激活以RAS和細胞外信號調節激酶(ERK)活性增加為特征的旁路途徑[3]。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路的一個重要因子，能夠被多種刺激因子激活，引起多種內在調控基因的表達，從而導致細胞惡性增殖和轉化。譚婧瑾[4]研究發現，非小細胞肺癌患者肺組織中磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白的表達水平明顯高于癌旁正常組織。此外，有研究[5]表明炎癥與多種惡性腫瘤的發生有關，并且已有研究證實脂多糖(LPS)能夠加速4-(甲基亞硝氨基)-3-吡啶-1-丁酮[4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone,NNK)]誘導的小鼠肺部腫瘤的發生[6]。故本實驗采用苯并芘[B(a)P][7]替代NNK聯合LPS染毒，構造小鼠炎癥促癌模型，探討NF1和p-ERK1/2蛋白表達與炎性相關肺癌的關系，從而為其防治提供作用靶點。

1 材料與方法

1.1實驗動物來源SPF級C57BL/6小鼠，雌雄各半，體重20～30 g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，常規飼養于鄭州大學公共衛生學院動物房，自由飲水和進食，飼養溫度為18～22 ℃，晝夜節律同自然。

1.2實驗分組采用隨機數字表法將實驗動物分為4組：B(a)P聯合LPS組[B(a)P+LPS組，n=35)、單獨B(a)P組[B(a)P組，n=35]、單獨LPS組(LPS組，n=15)和三辛酸甘油酯聯合生理鹽水組[對照組，n=15]。B(a)P+LPS組小鼠經異氟烷麻醉后氣管內滴注B(a)p懸浮液，染毒劑量為1 mg/只(溶于50 μL三辛酸甘油酯)，每周1次，連續4周后停止，B(a)p染毒結束后記為第0周，第3周進行LPS氣管內滴注，染毒劑量為2.5 μg/只(溶于50 μL生理鹽水)，每3周1次，給予5次后停止。B(a)p組小鼠氣管內滴注1 mg/只的B(a)p懸浮液，每周1次，連續4周。LPS組每只小鼠氣管內滴注2.5 μg/只LPS溶液，每3周1次，連續給予5次。對照組小鼠氣管內滴注等體積的三辛酸甘油酯和無菌生理鹽水。

1.3觀察指標及方法染毒結束后，小鼠正常飼養，30周后對小鼠進行解剖，肉眼觀察小鼠肺部出現腫瘤的數量和出現肺癌的小鼠數，計算肺癌發生率和各組小鼠平均腫瘤形成數。取左側肺葉固定在40 g/L多聚甲醛中，石蠟包埋，檢測肺部相關蛋白的表達。

1.4肺癌組織中NF1、p-ERK1/2蛋白表達的免疫組化檢測肺組織切片經脫蠟水化、抗原修復、滅活內源性過氧化物酶后，用山羊血清室溫封閉30 min，滴加兔抗小鼠NF1和p-ERK1/2(均按1∶100稀釋)4 ℃孵育過夜，然后滴加山羊抗兔二抗室溫孵育50 min，最后經DAB顯色和蘇木素復染后脫水封片。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。山羊抗兔二抗、兔抗小鼠p-ERK1/2抗體和兔抗小鼠NF1抗體購自北京博奧森生物技術公司；SP雙標記染色試劑盒和DAB顯色劑購自武漢谷歌生物技術有限公司。結果判定：NF1和p-ERK1/2蛋白以著色呈淺黃色至棕褐色為陽性細胞。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測量3個視野(×200)下陽性區域面積和累積光密度，通過公式(平均光密度=累積光密度/陽性表達區域面積)計算并分析數據[8]。

1.5統計學處理采用SPSS 21.0對數據進行分析。應用χ2檢驗比較各組小鼠肺部成瘤率，采用非參數秩和檢驗比較各組小鼠平均腫瘤形成數，應用完全隨機設計的方差分析和Bonferroni檢驗比較各組小鼠腫瘤組織中NF1蛋白和p-ERK1/2蛋白表達的差異。應用Pearson相關分析各組肺組織中NF1和p-ERK1/2蛋白表達的相關性，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組小鼠肺部成瘤情況對照組與LPS組小鼠未形成腫瘤；B(a)p+LPS組小鼠腫瘤形成率(96.97%)高于B(a)p組(82.05%)(χ2=4.028，P=0.045)；B(a)p+LPS組小鼠的平均腫瘤形成數[10.0(4.0,19.2)]高于B(a)p組[3.0(1.0,6.0)](Z=3.762，P<0.001)。

2.2各組小鼠肺癌組織中NF1和p-ERK1/2蛋白的表達見圖1、2和表1。NF1蛋白主要表達于細胞核，在癌巢部位多呈低表達或不表達，在正常組織中明顯表達；p-ERK1/2蛋白主要表達于細胞質，在癌巢部位多呈高表達狀態，在正常組織中散在分布。

2.3各組小鼠肺癌組織中NF1和p-ERK1/2蛋白表達的相關性見表2。B(a)p+LPS組兩者的Pearson相關系數為-0.771(P<0.05)，其他3組兩蛋白表達無相關性。

A：肺泡；B：細支氣管；1：對照組；2：LPS組；3：B(a)p組；4：B(a)p+LPS組

A：肺泡；B：細支氣管；1：對照組；2：LPS組；3：B(a)p組；4：B(a)p+LPS組

表1 各組小鼠肺癌組織中NF1和p-ERK1/2蛋白表達的比較

*：與對照組相比，P<0.05；#：與B(a)p組相比，P<0.05

表2 各組小鼠肺癌組織中NF1和p-ERK1/2蛋白表達的相關性分析

3 討論

腫瘤的發生、進展受腫瘤微環境調控，慢性炎癥在腫瘤發生過程中發揮著極其重要的作用[9]。腫瘤微環境中炎性細胞和因子的長期存在可以促進腫瘤細胞的生長，抑制凋亡。研究[10]發現LPS作為一種內毒素能夠誘導炎癥反應，通過改變腫瘤微環境而參與癌癥的發生發展。本研究結果顯示，單獨LPS作用并不誘發肺癌，單獨B(a)p可誘導肺癌發生；而與B(a)p組相比，B(a)p+LPS組小鼠的腫瘤形成率升高、小鼠的平均腫瘤形成數明顯增加，提示LPS確實可以通過介導炎癥加重B(a)p誘導的肺癌的形成。

NF1基因已被確認為抑癌基因，其突變、缺失與腫瘤的發生、進展、疾病的療效、預后，甚至和某些腫瘤的不良抵抗有關[11]。杜珊等[12]在一項胃癌研究中發現NF1蛋白在胃癌組織中的陽性表達率低于正常胃組織，NF1蛋白高表達組的生存率高于低表達組。另外，張鵬[13]在對未分化多形性肉瘤(UPS)的研究中發現瘤組織中NF1蛋白表達陽性率低于瘤旁正常肌肉組織。本實驗結果顯示NF1蛋白在肺部正常組織中明顯表達，而在癌組織中多呈低表達或不表達；與對照組相比，B(a)p+LPS和B(a)p組NF1蛋白表達降低，提示NF1可能具有抑癌基因的功能，與以往的研究結果一致。B(a)p+LPS組NF1蛋白表達水平與B(a)p組相比亦明顯降低，表明炎癥的存在能夠使肺癌加重。

NF1基因缺失會引起Ras超活化，隨后導致Raf/MEK/ERK信號通路的激活。 ERK是MAPKs家族的重要成員之一，在絲裂原受相應信號刺激后，ERK接受上游的級聯反應信號轉化為p-ERK進入細胞核，活化細胞核內的某些轉錄因子，進而參與細胞的調控及增殖[14-15]。王西潔[16]通過免疫組化法檢測發現TNMⅢ～Ⅳ期肺癌組織中p-ERK蛋白表達高于Ⅰ～Ⅱ期，并且高于正常肺組織。本研究結果顯示，p-ERK1/2蛋白在肺癌組織中高表達，在正常組織中低表達且散在分布；與對照組相比，B(a)p+LPS和B(a)p組的p-ERK1/2蛋白表達增加，這與上述研究結果一致。

為了探究肺癌組織中NF1和p-ERK1/2蛋白表達之間的關系，本研究進行了相關分析，結果表明NF1與p-ERK1/2蛋白的表達呈負相關，這證實NF1作為RAS蛋白的負調節因子，其表達產物減少使RAS通路不斷激活，進而使下游的ERK磷酸化水平升高[17]。然而B(a)p+LPS組與B(a)p組相比以及LPS組與對照組相比p-ERK1/2蛋白的表達均無統計學意義，其原因可能是除了NF1低表達導致RAS-ERK通路的持續激活外，還可能有其他的因子參與ERK的調控，如蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)對ERK通路的活化。

綜上所述，NF1蛋白在肺癌組織中低表達，p-ERK1/2蛋白呈高表達，兩者表達呈負相關，提示NF1作為一種抑癌基因其正常表達可抑制肺癌的發生發展；低表達時RAS下游的RAF/MEK/ERK通路持續激活，從而使p-ERK1/2蛋白表達水平升高，細胞發生癌變和增殖。探索NF1和p-ERK1/2蛋白在肺癌中的表達情況，有助于對肺癌發病機制進行更深了解，開辟腫瘤治療新途徑。