上調(diào)miR-15a表達(dá)對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡和NOB1蛋白表達(dá)的影響

王 慧，耿 玲， 郭 威， 劉慧源， 耿旭景

1)駐馬店市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 河南駐馬店 463000 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)部 鄭州 450014

子宮內(nèi)膜癌是常見的女性惡性腫瘤，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，尋找有效的分子標(biāo)記物對于子宮內(nèi)膜癌的診治具有重要意義[1]。miRNA在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮類似抑癌基因或癌基因的作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡等過程[2]。miR-15a屬于miR-15家族，在人體組織中廣泛存在，參與調(diào)控軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞的生長和分化[3-4]。miR-15a在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮抑制作用，目前在乳腺癌、胰腺癌等腫瘤中已經(jīng)證實[5-6]。miR-15a可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲和遷移，在子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制作用[7]。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示NOB1的3′UTR含有與miR-15a結(jié)合的位點，提示NOB1可能是miR-15a的靶基因。NOB1是一種RNA結(jié)合蛋白，參與宮頸癌[8]、膠質(zhì)瘤[9]、肝癌[10]等腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實驗通過轉(zhuǎn)染miR-15a模擬物(mimics)至子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞，觀察上調(diào)miR-15a表達(dá)對RL-952細(xì)胞增殖、凋亡的影響，驗證miR-15a和NOB1的靶向關(guān)系，為明確子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機制和分子靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源及主要試劑、儀器RL-952細(xì)胞購自上海研晶生物科技有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司，LightCycler480 PCR儀購自美國Roche公司，Thermo FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。SDS-PAGE試劑盒、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Bcl-2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Bax抗體、NOB1抗體購自美國Proteintech公司。miRNA cDNA合成試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；miR-15a mimics及其陰性對照、NOB1過表達(dá)載體(pcDNA3.1-NOB1)和空載體(pcDNA3.1)均由基爾頓生物科技(上海)有限公司構(gòu)建；psiCHECK-2熒光素酶報告載體購自北京合生基因科技有限公司。

1.2實驗分組將對數(shù)生長期的RL-952細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2×105個細(xì)胞。待細(xì)胞生長融合至60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。取無菌的1.5 mL EP管(A管)加入miR-15a mimics(miR-15a組)或陰性對照(miR-NC組)，再加入200 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打，混合均勻，室溫條件下放置5 min。另取無菌的1.5 mL EP管(B管)加入15 μL 脂質(zhì)體Lipofectamine2000，再加入200 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打，混合均勻，室溫條件下放置5 min。將A、B管中的溶液混合均勻，室溫放置15 min，然后滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、相對濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時設(shè)置空白對照組，細(xì)胞不做轉(zhuǎn)染處理，正常培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 3組細(xì)胞中miR-15a 表達(dá)水平的檢測分組培養(yǎng)48 h后，qRT-PCR法測定細(xì)胞中miR-15a的表達(dá)。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測定濃度和純度后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系：2×miRNA Reaction Buffer Mix 5 μL、BSA封堵液1 μL、miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL、總RNA 1 μL，加RNase-free水至10 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃孵育1 h，85 ℃孵育5 s。PCR反應(yīng)體系：0.4 μmol/L的上、下游引物各2 μL，SYBR Premix Ex Taq TMII 20 μL，cDNA模板4 μL，添加RNase-free水至40 μL。反應(yīng)條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，共40個循環(huán)。引物由南京金斯瑞合成。miR-15a上游引物序列為5’-GCGGTAGCAGCACATAA-3’，下游為 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。U6上游引物序列為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游為5’-CGCTTCACGAATTTGCGTCTCAT-3’。采用2-ΔΔCt法計算miR-15a相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.4 3組細(xì)胞增殖能力的CCK-8法檢測分別將3組細(xì)胞接種到96孔板中，每孔5×103個，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、濕度為97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8工作液和100 μL的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結(jié)束后，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測吸光度(A)。以A值表示細(xì)胞增殖能力。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.5 3組細(xì)胞克隆形成能力的檢測采用平板克隆實驗檢測。分別將3組細(xì)胞接種到6孔板中，每孔500個細(xì)胞，十字交叉晃動以使細(xì)胞均勻分布。3～4 d換液1次，培養(yǎng)10～14 d后，出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆團(tuán)。吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌，然后以40 g/L多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，對≥50個細(xì)胞的克隆團(tuán)進(jìn)行計數(shù)。克隆形成率=克隆團(tuán)數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.6 3組細(xì)胞凋亡率的檢測分組培養(yǎng)2 d以后，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。收集3組細(xì)胞，用PBS洗滌，然后用2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集消化液，1 000×g離心5 min， PBS再洗1次。添加195 μL結(jié)合緩沖液，然后加入5 μL Annexin V-FITC，于避光條件下反應(yīng)5 min。再加入190 μL結(jié)合緩沖液，添加10 μL PI染液，避光孵育10 min。立即上流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.7 3組細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的檢測采用Western blot法檢測。分別收集3組細(xì)胞，用含1 mmol/L PMSF的蛋白裂解液于冰上裂解細(xì)胞20 min，12 000×g離心5 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。以每泳道20 μg上樣量行SDS-PAGE，蛋白分離后轉(zhuǎn)PVDF膜，用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h。加入Bax抗體(稀釋度1∶400)、Bcl-2抗體(稀釋度1∶400)，4 ℃孵育過夜。加入HRP標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶200)，室溫孵育1 h,ECL顯色。用Quantity One分析條帶光密度值。內(nèi)參為GAPDH。以目的條帶與GAPDH條帶光密度的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.8miR-15a和NOB1靶向關(guān)系的預(yù)測和鑒定使用互聯(lián)網(wǎng)靶基因預(yù)測軟件Targetscan預(yù)測miR-15a的靶基因，結(jié)果顯示NOB1的3′UTR端與miR-15a有結(jié)合位點,利用熒光素酶報告實驗鑒定兩者的靶向關(guān)系。PCR擴增NOB1的3′UTR端序列，克隆到psiCHECK-2載體的Xho和Not酶切位點之間，構(gòu)建野生型(WT)熒光素酶報告載體。利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點突變后構(gòu)建突變型(MUT)熒光素酶報告載體。將WT、MUT載體分別與陰性對照、miR-15a mimics轉(zhuǎn)染到RL-952細(xì)胞中，48 h后檢測熒光素酶活性，Western blot法檢測NOB1表達(dá)水平，操作同1.7，其中NOB1抗體稀釋度為1∶600。

1.9過表達(dá)NOB1和上調(diào)miR-15a表達(dá)后RL-952細(xì)胞增殖、克隆形成能力及凋亡的變化將miR-15a mimics和pcDNA3.1-NOB1共轉(zhuǎn)染至RL-952細(xì)胞中(miR-15a+NOB1組)，同時將miR-15a mimics和空載體共轉(zhuǎn)染至RL-952細(xì)胞中(miR-15a+NC組)，培養(yǎng)48 h后，分別以CCK-8法、平板克隆實驗、Annexin V-FITC/PI雙染法測定細(xì)胞增殖能力、克隆形成率、凋亡率，Western blot法檢測細(xì)胞中NOB1(一抗稀釋度1∶600)、Bax(一抗稀釋度1∶400)、Bcl-2(一抗稀釋度1∶400)蛋白表達(dá)水平，操作同前。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)均用SPSS21.0分析。miR-NC、miR-15a組熒光素酶活性、NOB1蛋白表達(dá)水平，以及miR-15a+NC組與miR-15a+NOB1組各指標(biāo)的比較采用兩獨立樣本t檢驗；空白對照組、miR-NC及miR-15a組各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1空白對照、miR-NC、miR-15a組細(xì)胞中miR-15a表達(dá)水平及細(xì)胞活性的比較見表1。與空白對照、miR-NC組比較，miR-15a組細(xì)胞中miR-15a表達(dá)水平升高，細(xì)胞增殖能力、克隆形成率降低，凋亡率升高。

2.2空白對照、miR-NC、miR-15a組細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的比較見圖1和表1。與空白對照、miR-NC組比較，miR-15a組細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低。

1、2、3：分別為空白對照組、miR-NC組、miR-15a組

表1 3組細(xì)胞中miR-15a表達(dá)水平、細(xì)胞增殖能力、克隆形成率、凋亡率及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的比較

*：與空白對照組和miR-NC組比較，P<0.05

2.3miR-15a和NOB1靶向關(guān)系的驗證經(jīng)Targetscan靶基因在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-15a與NOB1的3′UTR端有堿基互補結(jié)合位點(圖2)。WT 3′UTR和miR-15a mimics共轉(zhuǎn)染的RL-952細(xì)胞熒光素酶活性降低(表2)，說明miR-15a可與NOB1的3′UTR靶向結(jié)合。與miR-NC組比較，miR-15a組NOB1蛋白表達(dá)水平降低(表2)。

2.4NOB1過表達(dá)和上調(diào)miR-15a表達(dá)對RL-952細(xì)胞增殖、克隆形成能力及凋亡的影響見表3。與miR-15a+NC組比較，miR-15a+NOB1組細(xì)胞增殖能力、克隆形成率升高，凋亡率降低，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平下降，Bcl-2、NOB1表達(dá)水平升高。

圖2 miR-15a與NOB1的靶向關(guān)系

3 討論

研究[11]顯示，miRNA在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。miR-15a基因定位于染色體13q14，參與多種病理及生理過程。研究[12]顯示，miR-15a參與膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡過程，與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)。miR-15a可以減少阿爾茨海默病神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[13]。miR-15a在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，已經(jīng)證實的有子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、腎癌等[6-7,14]。miR-15a還能夠抑制胃癌、肝癌細(xì)胞的生長[15-16]。有研究[7]報道，miR-15a在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Bcl-2蛋白家族是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的調(diào)控因子，其可以分成兩種，一種是在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮促進(jìn)作用的促凋亡蛋白，另外一種是在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮抑制作用的抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞凋亡水平[17-18]。本實驗結(jié)果顯示，上調(diào)miR-15a表達(dá)后子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞的增殖和克隆形成能力下降，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，提示miR-15a具有誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖的作用，具有抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長的功能。

miR-15a發(fā)揮生物學(xué)作用與靶向調(diào)控基因的表達(dá)有關(guān)，現(xiàn)階段已知CXCL10、NF-κB等是miR-15a的靶基因[19-20]。我們利用預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)，miR-15a和NOB1可能具有靶向關(guān)系。NOB1是一個在腫瘤組織中高表達(dá)的癌基因，其具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和抑制凋亡的作用[21]。我們進(jìn)一步利用雙熒光素酶報告實驗證實了miR-15a可以靶向負(fù)調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中NOB1蛋白的表達(dá)；提高RL-952細(xì)胞中NOB1蛋白的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖、克隆形成能力均升高，凋亡率降低，Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高。上述研究結(jié)果提示miR-15a可能通過抑制NOB1發(fā)揮抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。

綜上，提高腫瘤細(xì)胞中miR-15a表達(dá)可能是治療子宮內(nèi)膜癌的途徑之一。對于這一結(jié)論，在以后的實驗中我們會在多株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中進(jìn)行驗證，并探討可能的具體機制。