上調(diào)睪丸特異性Y樣蛋白5的表達(dá)對LoVo細(xì)胞侵襲、遷移及STAT3蛋白表達(dá)的影響

付 強，張金岱，謝建國

河南省腫瘤醫(yī)院(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院)普外科 鄭州 450008

結(jié)直腸癌是常見的消化道腫瘤之一，隨著我國人口老齡化及其他致癌因素的增加，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人們的生命健康[1]。腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移是引起結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)死亡的一個主要原因。上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞在特定生理病理條件下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象;已證實EMT與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是決定腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移程度的一個關(guān)鍵因素[2]。多項研究[3-4]也表明，抑制EMT可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力。睪丸特異性Y樣蛋白5(testis-specific Y-encoded-like protein 5，TSPYL5)是新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，屬于TSPYL家族成員之一，定位于常染色體8q22.1，在人體正常組織表達(dá)廣泛，而在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)[5]。有研究[6]表明，結(jié)腸癌組織中TSPYL5的表達(dá)低于癌旁正常黏膜，且其表達(dá)隨TNM分期及浸潤深度的增加而下調(diào)。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STATs)家族成員之一，在多種腫瘤中異常活化，被稱為癌基因，異常活化的STAT3信號通路可通過調(diào)控EMT促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[7]。本研究旨在觀察上調(diào)TSPYL5的表達(dá)對結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響，并進(jìn)一步研究其對EMT相關(guān)蛋白及STAT3蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料人結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，TSPYL5、E-cadherin、Vimentin、STAT3和p-STAT3抗體及HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購自美國CST公司，Transwell小室購自美國Corning Costar公司，BCA試劑盒購自美國Thermo公司，STAT3信號通路抑制劑AG490購自美國Sigma公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國ProteinSimple公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)LoVo細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d換液一次，細(xì)胞達(dá)70%～85%密度時用胰蛋白酶消化后傳代。實驗取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.3細(xì)胞分組LoVo細(xì)胞分為空白1組、空載體組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒)和TSPYL5質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TSPYL5重組質(zhì)粒，上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成)。以2×105個/孔密度接種LoVo細(xì)胞于6孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長達(dá)70%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)說明，依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒4 μg，于轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

1.4細(xì)胞侵襲能力檢測將120 μL的Matrigel膠(用2倍體積的無血清RPMI 1640稀釋)鋪在Transwell小室上室中，37 ℃、30 min后待膠凝固，將3組細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個/mL，上室中每孔加入200 μL細(xì)胞懸液(約1×105個/孔)，下室中加入500 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，24 h后取出Transwell小室，吸棄上室液體，棉簽輕輕拭掉Matrigel膠及未侵襲的細(xì)胞，PBS漂洗，甲醛固定，蘇木精染色，倒置顯微鏡選取5個視野(×400)，計數(shù)穿膜細(xì)胞，取均值。實驗重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞遷移能力檢測除Transwell小室上室未鋪Matrigel膠，其他操作同細(xì)胞侵襲能力檢測。實驗重復(fù)3次。

1.6TSPYL5、EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、Vimentin)、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的檢測用RIPA裂解液提取上述3組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品煮沸變性5 min，低速離心30 s，加入適量4×SDS，每孔上樣40 μg，經(jīng)10 g/L SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST在37 ℃下封閉1 h，加1∶500稀釋的TSPYL5、E-cadherin、Vimentin、STAT3和p-STAT3及1∶1 000稀釋的GAPDH抗體(內(nèi)參)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗5 min×3次，加1∶4 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育45 min。TBST漂洗5 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。用Image J軟件分析條帶灰度值。以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值為目的蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.7抑制STAT3蛋白后細(xì)胞侵襲與遷移能力以及E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)檢測取LoVo細(xì)胞，分為空白2組、AG490組(加50 μmol/L AG490)和AG490+TSPYL5質(zhì)粒組(50 μmol/L的AG490及pcDNA3.1-TSPYL5轉(zhuǎn)染)。處理48 h后，參照1.4和1.5方法檢測細(xì)胞侵襲及遷移能力，參照1.6方法檢測E-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析比較各組細(xì)胞以上指標(biāo)的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1空白1組、空載體組和TSPYL5質(zhì)粒組細(xì)胞TSPYL5蛋白表達(dá)及侵襲、遷移能力的比較結(jié)果見圖1、表1。與空白1組和空載體組比較，TSPYL5質(zhì)粒組細(xì)胞TSPYL5蛋白表達(dá)水平升高，侵襲和遷移能力降低。

1～3：分別為空白1組、空載體組和TSPYL5質(zhì)粒組

組別TSPYL5蛋白 侵襲細(xì)胞數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)空白1組0.041±0.008187.8±10.9142.6±7.7空載體組0.036±0.007184.9±9.2140.2±6.8TSPYL5質(zhì)粒組0.368±0.042?98.3±5.7?85.1±5.1?F173.55798.65872.389P<0.001<0.001<0.001

*：與空白1組和空載體組比較，P<0.05

2.2空白1組、空載體組和TSPYL5質(zhì)粒組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白及STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果見圖2、3和表2。與空白1組和空載體組比較，TSPYL5質(zhì)粒組E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，Vimentin和p-STAT3蛋白表達(dá)水平降低。

1～3：分別為空白1組、空載體組和轉(zhuǎn)染TSPYL5質(zhì)粒組

1～3：分別為空白1組、空載體組和轉(zhuǎn)染TSPYL5質(zhì)粒組

組別E-cadherinVimentinSTAT3p-STAT3空白1組0.132±0.0120.311±0.0280.669±0.0720.147±0.016空載體組0.143±0.0140.337±0.0340.678±0.0750.159±0.018TSPYL5質(zhì)粒組0.567±0.056?0.158±0.016?0.685±0.0740.029±0.006?F159.28738.3370.03675.409P<0.001<0.0010.965<0.001

*：與空白1組和空載體組比較，P<0.05

2.3空白2組、AG490組及AG490+TSPYL5質(zhì)粒組細(xì)胞侵襲、遷移能力及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的比較結(jié)果見表3。AG490組細(xì)胞侵襲及遷移能力均低于空白2組，而AG490+TSPYL5質(zhì)粒組細(xì)胞侵襲及遷移能力均低于AG490組；AG490組E-cadherin蛋白的表達(dá)高于空白2組，Vimentin蛋白的表達(dá)低于空白2組，而AG490+TSPYL5質(zhì)粒組E-cadherin蛋白的表達(dá)高于AG490組，Vimentin蛋白表達(dá)低于AG490組。

表3 3組細(xì)胞侵襲、遷移能力及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的比較(n=3)

*：與空白2組比較，P<0.05；#：與AG490組比較，P<0.05

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的病理過程，涉及抑癌基因失活、癌基因過度表達(dá)、DNA錯配修復(fù)的功能缺失等[8]。其中抑癌基因表達(dá)下調(diào)或失活被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的早期事件[9]。TSPYL5屬于TSPYL家族，是新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，參與染色質(zhì)構(gòu)成、各種細(xì)胞活動，同時也可能與調(diào)節(jié)基因表達(dá)有關(guān)[10]。目前TSPYL5的分子生物學(xué)功能及分子機(jī)制仍不明確。有研究[11-13]表明，胃癌中TSPYL5表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制細(xì)胞生長;TSPYL5在結(jié)直腸癌低表達(dá)，過表達(dá)TSPYL5可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和誘導(dǎo)凋亡;而肺腺癌A549細(xì)胞中TSPYL5表達(dá)上調(diào)，抑制其表達(dá)可抑制細(xì)胞生長。本研究結(jié)果表明，上調(diào)TSPYL5表達(dá)后，結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞侵襲和遷移能力降低，與文獻(xiàn)[12]報道一致。

EMT主要表現(xiàn)為E-cadherin和角蛋白等上皮標(biāo)志物表達(dá)缺失或降低，Vimentin和神經(jīng)鈣黏蛋白等間質(zhì)性標(biāo)志物表達(dá)增加，同時細(xì)胞形態(tài)向成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變，進(jìn)而獲得侵襲和遷移能力[14]。有研究[15-16]顯示，致癌基因FOXK1通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移；二苯乙烯苷通過PI3K/AKT通路抑制TGF-β誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌EMT，并降低其運動遷移能力。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)TSPYL5表達(dá)可抑制LoVo細(xì)胞Vimentin表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin表達(dá)，提示上調(diào)TSPYL5可通過逆轉(zhuǎn)EMT抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

許多信號通路可誘導(dǎo)EMT的產(chǎn)生，如活化的Wnt信號、NF-κB信號、Notch信號、STAT3信號通路等[17]。STAT3是STATs家族成員之一，與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，多種腫瘤中STAT3信號通路異常激活，活化的STAT3可轉(zhuǎn)錄激活下游的靶基因，進(jìn)一步引起一系列相關(guān)因子的激活和蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，因此STAT3被稱為癌基因[18-19]。研究[20]表明，抑制STAT3信號可阻礙腫瘤發(fā)生發(fā)展，因此抑制STAT3信號已成為腫瘤治療熱點。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)TSPYL5表達(dá)可抑制p-STAT3表達(dá)，提示上調(diào)TSPYL5表達(dá)可抑制STAT3信號。AG490為JAK2特異性抑制劑，可抑制STAT3信號，本研究進(jìn)一步探究抑制STAT3信號對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，結(jié)果顯示，在應(yīng)用AG490的基礎(chǔ)上，上調(diào)TSPYL5表達(dá)可進(jìn)一步抑制LoVo細(xì)胞侵襲和遷移能力，促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，抑制Vimentin的表達(dá)，提示上調(diào)TSPYL5表達(dá)可能通過逆轉(zhuǎn)EMT，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。

綜上所述，上調(diào)TSPYL5的表達(dá)可能通過抑制STAT3信號逆轉(zhuǎn)EMT，進(jìn)而降低結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。后續(xù)研究將致力于TSPYL5對結(jié)直腸癌細(xì)胞其他生物學(xué)特性、機(jī)制的研究及體內(nèi)研究，為結(jié)直腸癌的診療提供理論依據(jù)。