上調叉頭框轉錄因子J2對肺癌細胞凋亡及CHOP蛋白表達的影響

鄭連喜，鄧 超，何 平，屈 敏

1)攀鋼總醫院腫瘤科 四川攀枝花 617000 2)重慶三峽中心醫院腫瘤科 重慶 404000

肺癌是最為常見的呼吸系統惡性腫瘤，手術切除、放療、化療等是目前肺癌治療的常見手段，這些傳統的治療方法雖然取得了一定的成效，但仍然不能滿足需求，因此研究肺癌的發病機制對于肺癌的治療具有重要意義[1-2]。叉頭框轉錄因子J2(forkhead box J2，Foxj2)是Fox蛋白家族的成員，其在人類早期胚胎發育、心臟發育等過程中具有重要作用[3]。目前已發現，Foxj2參與調控細胞的生長，與細胞的多種生物學特性有關；Foxj2在腫瘤發生中扮演重要角色，其在膠質瘤、乳腺癌、肺癌等組織中表達下調，其表達水平降低預示著腫瘤患者預后不良[4-6]。近年來發現，內質網應激是細胞凋亡發生的重要途徑之一。本研究觀察了Foxj2過表達在肺癌細胞凋亡中的作用，同時觀察了凋亡相關蛋白[Cleaved Caspase-3(活化的Caspase-3)、Bax]和內質網應激相關蛋白[活化轉錄因子4(activating transcription factor 4,ATF4)和CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)]表達的變化，探討Foxj2在肺癌發生中的作用。

1 材料與方法

1.1材料肺癌A549、H1299、SPCA1細胞購自通派(上海)生物科技有限公司，正常肺HBE細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，細胞均用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液培養。qRT-PCR所用試劑均購自美國Thermo公司，所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，pLV-EGFP-Foxj2慢病毒和pLV-EGFP對照慢病毒由上海吉凱基因化學技術有限公司構建，Foxj2抗體購自美國Abcam公司，ATF4抗體、Cleaved Caspase-3抗體、CHOP抗體及兔抗羊HRP標記的IgG購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司， Bax抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2肺癌細胞和正常肺細胞中Foxj2表達的檢測①Foxj2 mRNA表達水平檢測：肺癌A549、H1299、SPCA1細胞和正常肺HBE細胞均用RNA提取試劑盒分別提取總RNA，反轉錄成cDNA。PCR引物序列：Foxj2 上游引物5’-TTCTCGAGTTATGGCTTCT GACCTAGAGAGTAGC-3’，下游引物5’-TAGGATC CAGTGATCAAGTCCCAGTCGAAGTC-3’；β-actin上游引物5’-GGACCTGACTGACTACCTC-3’，下游引物5’-TACTCCTGCTTGCTGAT-3’。反應體系：0.5 μL的 cDNA 模板，上、下游引物各0.3 μL，0.4 μL Passive Reference Dye，10 μL的2×TS Top Green qPCR SuperMix，8.5 μL的ddH2O。反應條件：94 ℃ 50 s；94 ℃ 5 s；56 ℃ 34 s，35個循環。用2-ΔΔCt法計算Foxj2 mRNA的表達水平。每組設3個復孔，實驗重復3次。

②Foxj2蛋白表達水平檢測：肺癌A549、H1299、SPCA1細胞和正常肺HBE細胞用RIPA裂解提取總蛋白后，BCA法測定蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，在上樣孔中加入50 μg的蛋白樣品和5 μL Marker，90 V恒壓下電泳分離。用半干法將蛋白轉移到PVDF膜上。將PVDF膜37 ℃封閉(體積分數5%的牛血清白蛋白)1 h后，在一抗孵育液(Foxj2抗體按1∶1 000稀釋)中4 ℃孵育10 h，再放在二抗(1∶3 000稀釋的兔抗羊HRP標記的IgG)孵育液中室溫反應2 h。滴加ECL發光液，應用Bio-rad采集圖片。Foxj2蛋白的表達水平為Foxj2條帶和β-actin條帶灰度值的比值。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.3細胞分組和感染效果驗證SPCA1細胞在感染前1 d接種于6孔板，分為3組，Foxj2組和陰性對照組分別感染pLV-EGFP-Foxj2慢病毒和pLV-EGFP對照慢病毒，未感染細胞為空白對照組。感染前更換細胞培養液，添加慢病毒液，使感染復數為30，感染后24 h換液，繼續培養3 d后用嘌呤霉素篩選。48 h后采用qRT-PCR和Western blot法檢測Foxj2的表達，步驟同1.2。

1.4 3組細胞增殖檢測將空白對照組、陰性對照組、Foxj2組細胞分別接種于96孔板，每孔約2 000個細胞，培養48 h后取出培養板，每孔添加10 μL MTT溶液，37 ℃反應4 h后，取出培養板，吸棄上清，添加DMSO溶液反應10 min，用酶聯免疫吸附儀測定波長450 nm的吸光度(A)值，經空白調零孔調零以后，計算各組細胞存活率。每組設3個復孔。存活率=實驗組A值/空白對照組A值×100%。實驗重復3次。

1.5 3組細胞凋亡檢測培養48 h后，空白對照組、陰性對照組、Foxj2組各取106個細胞，用冰預冷的PBS懸浮，1 000 ×g離心10 min，添加300 μL的結合緩沖液混合，再分別添加PI染液和Annexin V-FITC各5 μL混合，上流式細胞儀檢測前再添加200 μL的結合緩沖液。計算細胞凋亡率。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.6 3組細胞中Cleaved Caspase-3、Bax、ATF4、CHOP蛋白表達水平的檢測取空白對照組、陰性對照組、Foxj2組細胞，按照1.2中Western blot法步驟檢測細胞中Cleaved Caspase-3、Bax、ATF4、CHOP蛋白表達水平(Cleaved Caspase-3抗體按1∶5 000稀釋，Bax和ATF4抗體按1∶1 000稀釋，CHOP抗體按1∶2 000稀釋)。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0處理數據，用單因素方差分析比較4種細胞Foxj2表達水平的差異以及3組SPCA1細胞組間Foxj2表達水平、細胞存活率、凋亡率及Cleaved Caspase-3、Bax、ATF4、CHOP蛋白表達水平的差異，組間兩兩比較用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1肺癌細胞及正常肺細胞中Foxj2表達水平的比較結果見圖1、表1。肺癌A549、H1299、SPCA1細胞中的Foxj2 mRNA和蛋白表達水平均低于正常肺HBE細胞，其中SPCA1細胞中Foxj2 mRNA和蛋白表達水平低于H1299和A549細胞，故后續實驗選用Foxj2表達水平最低的SPCA1細胞。

1～4：分別為HBE、A549、H1299、SPCA1細胞

細胞Foxj2 mRNAFoxj2 蛋白HBE-0.68±0.08A5490.65±0.070.41±0.06?H12990.36±0.030.25±0.06?SPCA10.18±0.05#0.12±0.04?#F185.77145.921P<0.001<0.001

*:與HBE細胞比較，P<0.05；#:與A549細胞和H1299細胞比較，P<0.05

2.2 3組SPCA1細胞中Foxj2表達水平的比較結果見圖2、表2。與空白對照組和陰性對照組比較，Foxj2組SPCA1細胞中Foxj2 mRNA和蛋白表達水平上調。

2.3 3組SPCA1細胞存活率和凋亡率比較結果見表3。與空白對照組和陰性對照組比較，Foxj2組細胞存活率下降，細胞凋亡率升高。

1～3：分別為空白對照組、陰性對照組和Foxj2組

組別Foxj2 mRNAFoxj2 蛋白空白對照組-0.16±0.04陰性對照組0.98±0.110.15±0.06Foxj2組2.17±0.13?0.36±0.05?#t/F144.07216.403P<0.0010.004

*：與陰性對照組比較，P<0.05; #:與空白對照組比較，P<0.05

表3 3組SPCA1細胞存活率和凋亡率比較(n=9) %

組別存活率凋亡率空白對照組-3.20±0.74陰性對照組97.35±10.453.47±0.69Foxj2組62.89±9.12?26.95±3.78?#t/F20.052109.271P0.002<0.001

*:與陰性對照組比較，P<0.05;#：與空白對照組比較，P<0.05

2.4 3組SPCA1細胞中Cleaved Caspase-3、Bax、ATF4、CHOP蛋白表達水平的比較結果見圖3、表4。與空白對照組和陰性對照組比較，Foxj2組細胞中凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3、Bax及內質網應激蛋白ATF4、CHOP的表達升高。

1～3：分別為空白對照組、陰性對照組和Foxj2組

組別Cleaved Caspase-3BaxATF4CHOP空白對照組0.17±0.020.19±0.020.15±0.040.21±0.05陰性對照組0.16±0.050.20±0.030.16±0.030.23±0.04Foxj2組0.26±0.03?0.30±0.04?0.43±0.06?0.45±0.05?F7.18411.48337.23024.182P0.0260.009<0.0010.001

*:與空白對照組和陰性對照組比較，P<0.05

3 討論

Fox是眾多轉錄因子家族中的一個超級大家族，包含100多個蛋白家族成員，均含有一個由1～100個氨基酸組成的單體DNA結合區域，能夠與DNA結合誘導DNA分子發生回折[7-9]。Foxj2基因是Fox蛋白成員，含有2個DNA結合區域，能夠識別2種不同的DNA序列，同時也能夠被其他Fox轉錄因子識別。有研究[4-6,10-11]顯示，Foxj2在人體內所有組織中均有表達，在乳腺癌、肺癌、膠質瘤等腫瘤組織中Foxj2表達下調，Foxj2可能通過調控細胞的生長影響腫瘤的發生和發展。已有研究[3,12]表明過表達Foxj2可以誘導成年大鼠肺出血和心臟肥大。在肺癌中的研究顯示，STAT6基因沉默可以下調miR-197的表達，誘導細胞凋亡，而miR-197又可以靶向負調控的Foxj2表達；還有研究表明，過表達Foxj2可以抑制肺癌細胞上皮間質轉化，反之敲低Foxj2具有促進肺癌細胞轉移的作用，Foxj2可能在肺癌中發揮抑癌基因的作用[6,13]。本實驗結果顯示，Foxj2在肺癌細胞中的表達水平低于正常肺細胞，并且過表達Foxj2的肺癌細胞的增殖能力降低，與上述研究報道一致。

細胞凋亡減少是細胞癌變的重要特征之一，也是腫瘤發展的重要原因，目前的研究顯示，Caspase和Bcl-2是與細胞凋亡密切相關的兩大蛋白家族，Caspase被激活可以發生Caspase凋亡級聯反應，Caspase-3是位于該凋亡反應下游的執行因子，其只有被活化后才可以發揮促進細胞凋亡的作用；Bax是Bcl-2蛋白家族成員，其在細胞凋亡過程中發揮促進作用，Bax表達水平升高是細胞凋亡發生的標志[14-17]。細胞凋亡發生的具體機制目前尚不明確，近年來發現，內質網應激是細胞凋亡發生的重要途徑之一，CHOP表達上調是內質網應激發生的直接結果，ATF4是位于CHOP上游的內質網應激分子，其可以激活CHOP的表達[18-20]。研究[13,21]顯示，Foxj2誘導細胞發生內質網應激，這可能是其誘導細胞凋亡發生的途徑之一。本實驗的結果表明，過表達Foxj2后的肺癌細胞中Cleaved Caspase-3、Bax、ATF4、CHOP蛋白表達水平均升高，提示Foxj2可能通過激活肺癌細胞內質網凋亡途徑誘導Caspase凋亡反應和Bax蛋白表達，從而發揮凋亡促進的作用。

綜上所述，Foxj2在肺癌中發揮抑癌基因的作用，Foxj2在肺癌細胞中表達下調，過表達Foxj2可能通過內質網途徑誘導肺癌細胞凋亡。本實驗結果為研究Foxj2在腫瘤發生中的作用機制，并進一步闡明肺癌發病機制提供了參考。Foxj2如何靶向調控內質網應激尚不明確，有待后續進一步探索。