穩定同位素直接稀釋/超高效液相色譜-串聯質譜法測定葡萄酒中赭曲霉毒素A

王興龍，蔡 強，桂文鋒，蔡增軒，許嬌嬌，任一平*

(1.浙江清華長三角研究院 分析測試中心，浙江 嘉興 314000；2.上海師范大學 環境與地理科學學院，上海 200233；3.浙江省疾病預防控制中心，浙江 杭州 310000)

赭曲霉毒素(Ochratoxin)是一類主要由曲霉菌屬(Aspergillus)和青霉菌屬(Penicillium)的真菌產生的次級代謝產物，根據化學結構，可分為赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)、赭曲霉毒素B(Ochratoxin B,OTB)和赭曲霉毒素C(Ochratoxin C,OTC)。其中OTA的毒性最強，化學性質穩定，半衰期較長，可產生致畸[1]、致癌、腎毒性[2]、免疫毒性、肝細胞毒性[3]、神經毒性[4]等毒性。由于受葡萄生長條件和釀制工藝的影響，葡萄酒易造成赭曲霉毒素的污染。近年來，Yusefi等[5]對伊朗的70個葡萄汁樣本進行評估研究，發現55.7%的樣本中OTA濃度高于0.125 μg/L，平均污染水平為0.5 μg/L，最高達2.6 μg/L。劉青等[6]對9個國家11種不同種類的葡萄酒中赭曲霉毒素進行篩查，OTA的檢出率高達45.4%，檢出濃度為1.1～11.5 μg/L，有4個樣本超過2 μg/L。為有效控制葡萄酒中OTA 對人類健康產生危害，國內外相繼制定了限量標準，如我國GB 2761-2017標準[7]及歐盟法規[8]均規定OTA在葡萄酒中的最大殘留量為2 μg/kg。隨著葡萄酒中OTA風險評估研究的深入，對其檢驗方法不僅要求結果更加精準，而且要求前處理技術更加簡單、高效。

目前，酒類產品中真菌毒素的定量檢測方法主要有酶聯免疫吸附法[9]、高效液相色譜法[10-11]、液相色譜-串聯質譜法[12-13]等。其中，酶聯免疫吸附法的前處理相對簡單，主要用于快速篩查，但易出現假陽性。高效液相色譜法的準確度高、穩定性好，但對前處理要求較高，抗干擾能力較差。而液相色譜-串聯質譜法具有靈敏度高、選擇性好、分析效率高等優勢，逐漸成為赭曲霉毒素檢測的首選方法。目前，液相色譜-串聯質譜法檢測葡萄及其制品中真菌毒素的前處理技術主要有固相萃取柱凈化[14-15]、免疫親和柱凈化[5，16]、分散液-液微萃取[17-18]以及QuEChERS[19-20]等方法。然而，上述前處理技術成本較高，過程相對復雜，易造成目標物損失，且無法滿足大批量樣本的同時檢測需求。

本研究將樣品直接稀釋、過濾膜處理，利用穩定同位素稀釋技術消除基質效應，建立了超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)檢測葡萄酒中OTA的方法。本方法簡單、高效、成本低，適用于大批量葡萄酒樣品中OTA的快速、準確定量檢測，可為葡萄酒中OTA的安全風險評估提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity H 超高效液相色譜儀、Waters TQD 三重四極桿串聯質譜儀(美國Waters公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

OTA(C20H18ClNO6,CAS號：303-47-9)及其穩定同位素13C20-OTA標準品：質量濃度均為 10 μg/L，購自Romer國際貿易(北京)有限公司。色譜純乙腈、甲酸，以及0.22 μm親水PTFE針式濾膜購于上海安譜實驗科技股份有限公司;實驗用水為超純水，由Milli-Q超純水儀制備。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 OTA標準儲備液移取適量的OTA標準品溶液，用乙腈稀釋至10 mL，配制成100 μg/L的標準儲備液，于-20 ℃保存。

1.2.213C20-OTA工作溶液移取適量的13C20-OTA標準品溶液，用乙腈稀釋至5 mL，配制成5 μg/L的穩定同位素工作溶液，于-20 ℃避光保存。

1.2.3 OTA標準工作溶液準確移取適量的OTA標準儲備液，用乙腈-水-甲酸( 29.8∶70∶0.2，體積比)溶液逐級稀釋，分別配成0.05、0.1、0.2、0.5、1 μg/L的OTA標準工作溶液。移取20 μL13C20-OTA工作溶液與180 μL OTA 標準工作溶液于300 μL進樣小瓶中，充分混勻，待測。

1.3 樣品前處理

準確移取100 μL試樣于1.5 mL離心管中，加入900 μL乙腈-水-甲酸(29.8∶70∶0.2)溶液，渦旋混勻后，過0.22 μm PTFE針式濾膜。移取20 μL13C20-OTA工作溶液于300 μL進樣小瓶中，加入180 μL樣品濾液，充分混勻后，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件ACQUITY BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫為40 ℃；進樣體積為10 μL；流速為0.3 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈。洗脫條件：0～1.0 min，70%A；1.0～4.5 min，70%～5%A；4.5～6.5 min，5%A；6.5～9.5 min，5%～70%A。

1.4.2 質譜條件電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描；毛細管電壓為3.0 kV；離子源溫度為150 ℃；脫溶劑氣溫度為500 ℃；脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔反吹氣流速為30 L/h；多反應監測模式(MRM)采集。

2 結果與討論

2.1 質譜參數的優化

在ESI+模式下，采用MS Scan模式，對500 ng/mL的OTA及13C20-OTA分別進行一級質譜全掃描分析，得到每種目標物的母離子。比較不同錐孔電壓下母離子的響應強度，以最大響應值時為最佳錐孔電壓。采用Daughter模式，在不同碰撞能量下，對目標物母離子分別進行二級質譜全掃描，得到每種母離子的碎片離子，比較不同碰撞能量下碎片離子的響應強度，選擇響應強度較高的兩個子離子作為定量離子和定性離子，優化的質譜參數見表1。在上述優化條件下，OTA及13C20-OTA的總離子流圖見圖1。

表1 OTA及其同位素的質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters of OTA and its isotope

*quantitative ion

2.2 前處理條件的優化

葡萄酒基質相對復雜，含多種抗氧化劑、色素、葡萄糖與果糖等成分。在ESI+模式下，OTA及13C20-OTA的離子化效率易受到基質干擾，從而影響定量檢測。本實驗按照下式評估基質效應：ME=|C-A|/B×100%[21]，式中，C為樣品加標1 μg/L測定的峰面積，A為樣品本底的峰面積，B為OTA濃度為1 μg/L的溶劑標準品的峰面積。若ME=100%，說明無基質效應；ME>100%，說明存在基質增強效應；ME<100%，說明存在基質抑制效應。將葡萄酒樣品經乙腈-水-甲酸(29.8∶70∶0.2)溶液分別稀釋5、10、20倍后按照本方法進行分析，結果顯示，3種稀釋倍數下的基質效應均接近100%，說明直接稀釋可基本消除基質效應。綜合考慮方法靈敏度與儀器污染，本實驗將稀釋倍數設為10倍，同時加入穩定同位素作為內標[22- 23]，以降低質譜儀器波動的影響，保證實驗結果更加可靠。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系、檢出限與定量下限在優化條件下，采用內標法對質量濃度為0.05～1 μg/L的OTA標準工作溶液進行測定，以OTA與13C20-OTA的峰面積比值為縱坐標(Y)，OTA的質量濃度為橫坐標(X，μg/L)進行線性擬合。結果表明，13C20-OTA的質量濃度為 0.5 μg/L時，OTA在0.05～1 μg/L范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=18.264 5X+0.105 421，相關系數(r2)為0.999 6。在空白樣品中加入一系列不同濃度的標準品，按本方法進行前處理后進樣分析，得到OTA的檢出限(LOD，S/N≥3)和定量下限(LOQ，S/N≥10)分別為0.1、0.3 μg/L。

2.3.2 準確度與精密度針對紅葡萄酒和白葡萄酒2種空白樣品進行1.00、2.00、5.00 μg/L 3個水平的加標回收實驗，每個加標水平測定6 次，通過內標法計算加標回收率，并計算同一濃度水平的相對標準偏差(RSD)，作為日內精密度。按照以上操作連續測定3 d，以每天對應濃度的平均值計算RSD，作為日間精密度。結果如表2所示，OTA的回收率為102%～113%，日內、日間的RSD均小于10%，說明該方法的準確度和精密度良好。

表2 OTA的加標回收率及相對標準偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of OTA

2.4 方法比較

為驗證本方法的可行性，以空白葡萄酒為基質，OTA的加標濃度設為 2 μg/L，參考GB 5009.96-2016[24]第三法，采用免疫親和柱凈化法與本實驗建立的直接稀釋法，在相同的分析條件下進行測定，比較加標回收結果是否存在顯著性差異，結果如表3所示。經計算，t值為0.71，小于t(0.05,10)=2.23，說明兩種前處理方法的結果一致。

2.5 實際樣品檢測

通過市場采購，選取橡木桶、白楊河、長城、威龍、香格里拉、天然、赤霞珠、梅洛等國產品牌的15種紅葡萄酒和5種白葡萄酒，采用本方法進行檢測。結果顯示，所有樣本中均未檢出OTA，表明上述樣品滿足歐盟和我國食品安全標準對于葡萄酒中OTA的限量要求。

3 結 論

本文建立了葡萄酒中OTA的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，通過直接稀釋的前處理方法，并結合穩定同位素內標定量技術，避免了目標物損失，保證了測定結果準確、可靠。本方法前處理簡單、高效、靈敏度高、成本低，適合大批量葡萄酒中OTA的快速、準確定量檢測，同時還可用于葡萄酒中多種真菌毒素的檢測。