復合菌系預處理和強化對玉米秸稈沼氣發酵效率的影響

祝其麗, 王彥偉, 譚芙蓉, 吳 波, 代立春, 胡國全, 何明雄

(1.農業部農村可再生能源開發與利用重點實驗室 農業部沼氣科學研究所， 成都 610041； 2.國家成都農業科技中心, 成都 610041)

能源危機和環境污染已成為當今世界發展的兩大難題[1]，而以秸稈為主要原料的生物質沼氣發酵技術是有效緩解該問題的關鍵技術之一[2]。但由于秸稈等木質纖維素原料結構復雜、致密，難以水解酸化，致使目前秸稈沼氣化利用效率較低[3]，嚴重制約了秸稈類農業廢棄物資源化利用進程。因此，深入開展秸稈沼氣發酵效率提升技術研究對解決秸稈沼氣化利用技術瓶頸具有重要意義。

研究表明，預處理技術可以促進木質纖維素的水解，從而有利于提高沼氣發酵效率[4]。如蘆葦經蒸汽爆破預處理后的甲烷產量提高了89%[5]，水稻秸稈經真菌處理后的甲烷產量提高了78.3%[6]。目前，應用最為廣泛的木質纖維素預處理方法主要分為物理、化學、生物3類[7]。其中，生物預處理因具有能耗小、成本低、環境友好等特點受到了廣泛關注[3]。而復合菌系作為一種有效的生物預處理方法，能夠充分發揮不同功能微生物之間的協同作用，解除代謝產物的反饋抑制，促進纖維素轉化[8-9]。由于在大多數情況下，木質纖維素原料滅菌不是必需的，這可以幫助降低成本和節省時間，因此復合菌系用于預處理對于大規模生物質生產是有利的[3-4,10]。目前研究報道用于降解木質纖維素的復合菌系主要分為兩類[11]：一類是從特殊環境中直接獲得的，如瘤胃液、厭氧消化液等。第二類是從自然環境(土壤、污泥等)中篩選分離構建的，也是目前研究較多的一類復合菌系，如MC1[4,12-13],WSD-5[14],WSC-6[15],XDC-2[16],MCHCA[17]等，研究表明這些復合菌系均能不同程度地提升秸稈纖維素生物質沼氣發酵效率。

生物強化，是指通過向生物系統添加選擇的菌株或混合培養物而用于改善難降解的有機物分解代謝，近年來作為旨在提高生物燃料產物產量的替代方法，例如乙醇，氫氣和甲烷[11]。與旨在改善木質纖維素材料生產沼氣的生物預處理方法相比，生物強化技術具有一定的優勢，包括需要更少的時間，更低的成本，更少的干物質損失和毒性劃界[11, 18]。根據最近的研究，生物強化技術被證實可加速酸化，進一步改善木質纖維素材料的沼氣發酵[19-20]。

目前已有研究不同復合菌系預處理對木質纖維素生物質沼氣發酵效率的影響[7]，以及不同生物強化處理對沼氣發酵的影響[19,21]。然而，少有關于復合菌系預處理和生物強化處理對木質纖維素生物質沼氣發酵效果的比較研究。基于此，本文利用人工構建的復合菌系處理玉米秸稈，開展復合菌系預處理和強化對其沼氣發酵效率提升作用的比較研究，旨在為后續篩選和優化高效降解纖維素生物質的微生物處理技術，解決我國當前秸稈沼氣工程面臨的技術瓶頸提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米秸稈：取自四川省成都市郊區農田，取回的玉米秸稈在自然條件下風干后粉碎至約5 mm備用，其成分組成如表1。

厭氧活性污泥：取自農業部沼氣科學研究所微生物實驗室，其理化特性如表1。

好氧復合菌系AMC：通過實驗室剛果紅初篩，測定纖維素酶活及拮抗實驗，構建了包括Paenibacilluscucumis1株(分離于竹蟲腸道)，Bacillusaltitudinis2株(分離于瘤胃液),Bacillussubtilis3株(分離于土壤),Lysinibacillushalotolerans1株(分離于瘤胃液)等7株菌株的復合系。

厭氧復合菌系ANMC：以竹蟲腸道為樣本連續傳代富集培養至21代，梭菌屬(Clostridumsp.)為主要類群且群落結構穩定的復合系。

表1 玉米秸稈和厭氧活性污泥的特征 (%)

注：N.D.未檢測。

培養基：KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，FeCl30.01 g，CaCl20.1 g，H2O 1 L，另添加0.5 g·L-1的纖維素類物質。

1.2 秸稈預處理

將5 g玉米秸稈加入裝有100 mL培養基的250 mL錐形瓶中，另加入10 mL好氧復合菌液(接種量10%)，在30 ℃，160 rpm條件下處理3 d，即為秸稈預處理液，取樣測定處理后秸稈中纖維素、半纖維、木質素含量，同時進行電鏡掃描分析。

1.3 厭氧發酵

將秸稈按1∶1(VS)接種厭氧活性污泥進行批式發酵試驗，試驗采用500 mL發酵瓶，試驗設計分為3組：好氧處理組(AMC)：秸稈預處理液(5 g玉米秸稈+100 mL培養基+10 mL好氧復合菌液)+235 g厭氧活性污泥；厭氧處理組(ANMC)：5 g玉米秸稈+100 mL培養基+10 mL厭氧復合菌液+235 g厭氧活性污泥；對照組(Ctrl)：5 g玉米秸稈+100 mL培養基+10 mL超純水+235 g厭氧活性污泥；同時設置空白組。厭氧發酵溫度為中溫35 ℃±2 ℃，每個處理3個重復。

1.4 分析方法

1.4.1 常規理化指標分析

物料TS和VS的測定參照美國水和廢水監測標準方法[22]；纖維素、半纖維、木質素含量的測定采用美國國家可再生能源實驗室(NREL)標準分析方法[23]；總C和總N含量的測定采用有機元素分析儀(EAI CE440)進行分析。

厭氧發酵日產氣量采用排水集氣法測定；甲烷含量采用氣相色譜儀(GC122)分析，色譜柱為碳分子篩TDX-01，長度2 m，內徑2 mm，采用200 μL 定量環進樣，檢測器為TCD，色譜條件如下：柱箱溫度120 ℃，進樣器溫度120 ℃，檢測器溫度150 ℃，載氣為H2。

揮發性脂肪酸(VFA)濃度的測定：采用氣相色譜儀(GC102)分析，色譜柱為長度1.5 m，內徑2 mm的GDX-104填充柱，采用FID檢測器，色譜條件如下：柱箱溫度160 ℃，進樣器溫度210 ℃，檢測器溫度230 ℃，載氣為N2，進樣量為1 μL，H2流量30 mL·min-1，空氣流量為300 mL·min-1。

1.4.2 酶活分析

單株菌株和復合菌系分別在改良赫奇遜無機鹽培養基HM(KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，FeCl30.01 g，CaCl20.1 g，CMC-Na 5 g，H2O 1 L)30 ℃培養3 d后，8000 rpm離心10 min，上清液作為粗酶液，纖維素酶活性的測定采用DNS法[24-25]。本文分別對羧甲基纖維素酶、纖維二糖酶和濾紙酶的活性進行比較測定。濾紙酶活性的測定用 Whatman1號濾紙(1 cmx6 cm)條為底物，羧甲基纖維素酶活力的測定用1% 羧甲基纖維素鈉為底物，纖維二糖酶活力的測定用2%水楊素為底物。各底物分別采用pH 值為4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖(0.2 mol·L-1)。取稀釋酶液0.5 mL與1 mL上述底物及濾紙條充分混勻，在50 ℃水浴中溫育30 min，40 min，60 min后，加入DNS 顯色劑2 mL，沸水浴顯色10 min，流水冷卻，在540 nm下測定OD值，每測定重復3次，取平均值，同時設空白對照。以試驗條件下酶液蛋白含量在單位時間內酶促反應產生的還原糖(葡萄糖)量計算酶活性[25]。

1.4.3 掃描電子顯微鏡觀察

取少量預處理前后的秸稈樣品，制樣，用日本HITACHI TM-1000型掃描電子顯微鏡進行掃描，放大500倍觀察。

2 結果與討論

2.1 玉米秸稈預處理前后木質纖維素含量變化

纖維素降解率是表征秸稈生物質經預處理后生物降解特性的指標之一。表2所示為預處理前后玉米秸稈的木質纖維素含量及降解率。玉米秸稈經好氧復合菌液預處理3 d后纖維素、半纖維素、木質素含量為0.25，0.23，0.14 g·g-1，相比對照分別下降了16.7%，17.9%，12.5%，說明本試驗構建的好氧復合菌系AMC具有一定的纖維素降解性能。其中，半纖維的降解率大于纖維素，這是因為半纖維素主要的組成物質為易降解的糖類物質，包括木聚糖，葡糖醛酸氧基，阿拉伯木聚糖，葡甘露聚糖和木葡聚糖，與纖維素相比，其結構和組成的可變性增加，預處理過程中具有相對較高的降解速率[26]。因此，與纖維素相比，半纖維素顯示出相對容易水解，產生的單糖和乙酸能夠進行生物轉化以生產沼氣和其他有用的副產物[27]。而纖維素是由通過β-1-4糖苷鍵連接的葡萄糖單元組成的聚合物[28]，并且被木質素包裹，使其更難水解。木質素是一種復合的多苯基芳族化合物，通過酯鍵連接，它緊密結合纖維素和半纖維素，形成植物的一級和二級細胞壁[27]。此外，木質素對降解具有抗性，并且是有效利用纖維素和半纖維素的障礙[29]。 因此，復合菌系預處理的目的是破壞木質纖維素結構，這有助于改善水解過程，進一步促進木質纖維素生物質的沼氣發酵效率。

表2 復合菌系AMC預處理秸稈前后木質纖維素含量變化

2.2 酶活分析

纖維素分解是在多種纖維素酶的協同作用下完成的，是一個復雜的生物學過程[30]。因此，本試驗選取了3種常用的酶，對其活性進行分析，包括濾紙酶、羧甲基纖維素酶和纖維二糖酶[31]。其中，最能反映纖維素分解能力的指標是濾紙酶活[30]。分析結果如表3所示，本研究所構建的好氧復合菌系的濾紙酶活、羧甲基纖維素酶活、纖維二糖酶活分別為0.33 U·mL-1，1.69 U·mL-1，0.013 U·mL-1，均高于單菌酶活的上限值。這一結果與復合菌系對木質纖維素的分解能力遠高于單一菌株的研究結論是一致的[32]。

表3 單菌與人工構建復合菌系AMC的酶活 (U·mL-1)

項目單菌酶活復合菌系酶活濾紙酶 0.05～0.170.33羧甲基纖維素酶0.3～0.81.69纖維二糖酶 0～0.010.013

2.3 電鏡掃描分析

利用好氧復合菌系AMC預處理玉米秸稈前后的表觀形態結構變化如圖1和圖2所示。未經預處理的玉米秸稈表面結構緊密規整(見圖1 )，而經過預處理后的玉米秸稈結構明顯被破壞(見圖2)，表面出現很多碎片，結構更為松散，孔隙增多，表面附著的菌落清晰可見。電鏡分析結果說明本研究構建的好氧復合菌系分泌的各種纖維素酶發揮了協同作用，破壞了木質素對纖維素和半纖維的包裹作用，對木質纖維素進行了有效降解，有利于后續的水解和發酵[9]。

圖1 復合菌系AMC預處理前玉米秸稈掃描電鏡圖像(× 500倍)

圖2 復合菌系AMC預處理后玉米秸稈掃描電鏡圖像(× 500倍)

2.4 秸稈沼氣發酵效率分析

經復合菌系處理和未經處理的玉米秸稈厭氧發酵過程中日產沼氣量對比分析結果如圖3所示。三組試驗在發酵第1天均開始產氣，其中復合菌系預處理組(AMC)與對照組(Ctrl)變化趨勢相似，發酵初期日產氣量幾乎呈線性上升，在發酵第4天就達到產氣高峰，之后又逐漸下降，波動幅度較大；復合菌系強化處理組(ANMC)日產氣量變化則異于其他兩組，在整個發酵過程中波動幅度較小，且維持在一個相對較高水平，但產氣的最高峰值卻低于其他兩組。相應的甲烷含量變化如圖4所示。在厭氧發酵過程中，AMC和Ctrl的甲烷含量變化趨勢仍相似，從發酵初期逐漸上升至第4天達到50%以上，之后趨于穩定；而ANMC的甲烷含量在發酵初期明顯低于AMC和Ctrl，之后逐漸上升，最高可達61.4%，超過AMC和Ctrl的最高值，之后略有下降，最終穩定于54%左右。日產沼氣量和甲烷含量的結果表明，本研究人工馴化的厭氧復合菌系ANMC強化處理有利于緩解產氣波動，提高甲烷含量；而好氧復合菌液處理效果則不明顯。

生物甲烷產量是評價生物質能源轉化率與沼氣發酵效率的關鍵指標[24]。三組試驗的累積甲烷產量結果如圖5所示。總體上，兩組復合菌系處理均能提高玉米秸稈厭氧發酵過程中累積甲烷產量。在經歷40 d的厭氧發酵后，復合菌系強化處理組ANMC和復合菌系預處理組AMC的累積甲烷產量分別為242.56 mL·g-1Vs和233.09 mL·g-1Vs，相比對照依次提高了11.23%和6.89%，前者優于后者。究其原因，可能是由于AMC在對秸稈進行預處理的過程中雖然能有效促進木質纖維素的降解，將其轉化為可降解糖類物質，但自身也會消耗一部分糖維持其生長需要，導致用于后續厭氧發酵的糖類物質減少，進而抵消了其對產氣效率的提升作用。而ANMC是以梭菌屬(Clostridumsp.)為主要類群，這些梭菌可以促進水解，有利于纖維素的降解，提高產氣效率[33]。

圖3 玉米秸稈厭氧發酵日產氣量變化

圖4 玉米秸稈厭氧發酵過程中甲烷含量變化

圖5 厭氧發酵過程中累積甲烷產量變化

圖6 厭氧發酵過程中揮發酸含量變化

VFA 濃度是評價水解酸化和產甲烷平衡的重要指標[34]。3組試驗的總揮發酸(乙酸、丙酸、丁酸的總和)含量的變化如圖6所示，在發酵前16 d，ANMC的揮發酸含量顯著高于AMC和Ctrl，第6 天達到峰值2169.4 mg·L-1，這是因為厭氧復合菌系中的梭菌在代謝過程中會產生短鏈揮發性物質(如乙酸、丁酸等)。研究表明，TVFA 濃度小于4125 mg·L-1時對厭氧發酵的影響較小[35]。而乙酸、丁酸等短鏈揮發酸的產生對后續產甲烷過程是有益的，這也正是ANMC雖然揮發酸含量比其他兩組高，但產氣效率卻沒有受到抑制的原因。

綜合上述產氣效率指標分析結果，雖然本研究所構建的好氧和厭氧復合菌系均對玉米秸稈沼氣發酵效率具有提升作用，但效果相比已有的相關研究報道[13,37]尚不理想。例如，袁旭峰等采用復合菌系MC1處理玉米秸稈4 d后，可以獲得最大的秸稈總沼氣產量和總甲烷產量，相比對照分別提高了33.0%和58.1%[13]。Zhong等利用構建的復合菌系處理玉米秸稈15 d，其總沼氣產量、甲烷產量分別提升了33.1%、75.6%[37]。根據Zhang等人的研究，發現使用醋酸桿菌的生物強化可以提高纖維素和半纖維素的去除率，并在整個玉米秸稈的厭氧消化過程中將甲烷產量提高19%～23%[38]。然而，無論是否使用預處理或生物強化，本研究中的總沼氣產量和甲烷產量僅增加了13.02%和11.23%。一方面可能是由于本研究中復合菌系預處理秸稈的時間較短，僅3 d，低于大多數的研究報道[4,13,37]，纖維素未能得到高效降解；另一方面發酵初期未對發酵原料的各項參數(如pH值、碳氮比等)進行優化，不利于厭氧發酵的高效運行；同時也反映出此次構建的復合菌系對秸稈沼氣發酵效率提升效果有限，尚需進一步優化。但本文所得有關厭氧復合菌系提升秸稈沼氣發酵效率的結果及其與生物強化處理提升效果的比較分析將為下一步深入開展提升秸稈沼氣發酵的微生物學機理研究提供理論參考。

3 結論

(1)人工構建的好氧復合菌系AMC的纖維素酶活高于單菌；經AMC預處理后的玉米秸稈表面結構更為粗糙疏松，其纖維素、半纖維素、木質素降解率分別為17.86%，18.75%，16.67%。

(2)采用復合菌系AMC預處理和復合菌系ANMC強化均對玉米秸稈沼氣發酵效率具有提升作用，其累積甲烷產量相比對照分別提高了6.89%和11.23%；其中，ANMC對秸稈厭氧發酵過程中甲烷含量具有明顯的提升作用。