蛹蟲草提取物對大氣細顆粒物PM2.5致小鼠肺損傷的干預(yù)作用研究

洪艷，房磊，鄭義，*，陳安徽，張微，王琨

（1.徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇徐州221018；2.江蘇康能生物工程股份有限公司，江蘇南京210005）

PM2.5是特指空氣動力學直徑小于2.5 μm 的顆粒物，其組成成分復(fù)雜，主要包括元素碳、有機碳、重金屬、多環(huán)芳烴和生物成分等[1]。PM2.5主要經(jīng)呼吸道進入人體，易沉積在肺泡中從而造成肺部損傷，PM2.5暴露與肺炎、慢性阻塞性肺疾病等多種肺病的發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。PM2.5對肺損傷的作用機制仍未完全闡明，但其引起的氧化應(yīng)激和炎癥損傷等是目前較為公認的主要效應(yīng)機制[4]。研究表明，適當補充具有抗氧化功效的膳食補充劑，可減輕PM2.5暴露對機體的損傷[5]。

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是蟲草屬真菌的模式種，分布廣泛于世界各地，其無性型為蛹草擬青霉，屬子囊菌綱（Ascomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、麥角菌科（Clavicipitaceae）、蟲草屬（Cordyceps）[6]。蛹蟲草與冬蟲夏草Ophiocordyceps sinensis 為同一屬，許多藥用價值相通，并有希望替代昂貴的冬蟲夏草[7]。據(jù)吳征鎰所著的《新華本草綱要》中記載，蛹蟲草味甘性平，具有補肺益腎，補精髓，止血化痰的功效[8]。蛹蟲草富含蟲草素、蟲草酸、多糖、核苷、麥角甾醇、酶類等多種生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、保護肝臟及肺臟等多種藥理作用[9]。有報道表明，人工培植的冬蟲夏草和野生冬蟲夏草均具有促進PM2.5超細顆粒物從斑馬魚體內(nèi)排出進入腸道排出的作用[10]。蛹蟲草具有較好抗氧化活性，推測其可能對PM2.5所致肺損傷具有預(yù)防和保護作用，但有關(guān)蛹蟲草拮抗PM2.5致肺損傷的研究鮮見報道。本研究通過觀察PM2.5染毒對小鼠的肺損傷作用及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用，探討蛹蟲草提取物在PM2.5致小鼠肺損傷中的保護作用，旨在為防治環(huán)境污染所致的呼吸道疾病開拓新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草提取物：江蘇康能生物工程股份有限公司，其中多糖、蟲草素、腺苷含量分別為24.6 g/100 g、879 mg/100 g 和129 mg/100 g。昆明小鼠：許可證號SCXK 魯 20140007，（20±2）g，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、免疫球蛋白 IgA、IgG、IgM、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-18A 冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；FA2104N 電子分析天平、723C 可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；SW-CJ-2F 超凈工作臺：上海博遜實業(yè)有限公司；5804 多功能臺式離心機：德國艾本德公司；TGL-16 臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器有限公司；iMark 酶標儀：伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PM2.5 樣品采集和懸液制備

于徐州市非工業(yè)區(qū)使用大流量采樣器采用玻璃纖維濾膜采集大氣PM2.5（由徐州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心完成）。將采集到的PM2.5濾膜剪成1 cm×3 cm的細條狀，置于去離子水中，使用超聲波清洗器洗脫，3 000 r/min 離心20 min，取上清，冷凍干燥收集PM2.5粉末，用無菌生理鹽水配制成PM2.5混懸液，混勻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實驗動物分組及處理

小鼠飼養(yǎng)溫度19℃～22℃，濕度45%～55%。經(jīng)過一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，50 只小鼠隨機分為5 組，每組10 只小鼠，分別為正常組，PM2.5組，蛹蟲草提取物低、中、高劑量組。低、中、高試驗組分別灌胃50、100、200 mg/kg蛹蟲草提取物，正常組和PM2.5組灌胃生理鹽水，每天1 次。每組分別灌胃14 d 后，乙醚麻醉小鼠，微量注射器吸取0.1 mL PM2.5混懸液，PM2.5組和蛹蟲草提取物采用鼻腔滴注方式染毒PM2.（512 mg/kg），每組各染毒3 次，每次間隔24 h。正常組氣管滴注生理鹽水。

在末次染毒24 h 后，眼眶取血，頸椎脫臼處死小鼠并進行解剖。每組小鼠5 只用于炎性細胞分類計數(shù)，5 只用于組織樣品采集。

1.3.3 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）炎性細胞計數(shù)及炎性損傷檢測

小鼠處死后，用解剖剪刀從小鼠胸腔下剪開將小鼠胸腔暴露，用止血鉗夾住小鼠左肺葉，將支氣管從血管和食道間剝離，剪開一個小口，用灌肺針吸取預(yù)冷的生理鹽水溶液1 mL，將灌肺針插入小口后用手術(shù)線結(jié)扎防止生理鹽水從口鼻處流出，緩慢注入生理鹽水，輕輕按摩肺部后吸出，重復(fù)5 次后收集小鼠BALF。用生理鹽水調(diào)整細胞數(shù)，取20 μL BALF 涂板，25 ℃下干燥后，瑞氏-姬姆薩法染色計數(shù)100 個細胞，計算其中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數(shù)量。按照說明書檢測BALF 中ACP、AKP 和LDH 活性。

1.3.4 血清細胞因子與免疫球蛋白檢測

眼眶取血，25 ℃放置 30 min 后，3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，按照說明書檢測免疫球蛋白IgA、IgG、IgM、TNF-α 和 IL-6 含量。

1.3.5 肺組織氧化指標檢測

取小鼠右肺葉0.3 g，剪碎后加入9 倍體積預(yù)冷的生理鹽水，置于冰上充分研磨，3 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液，按照說明書測定小鼠肺組織TAOC、SOD、CAT、GSH-Px 活性及 MDA 含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 軟件進行分析，結(jié)果采用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PM2.5 對小鼠肺組織的炎性損傷作用及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用

2.1.1 PM2.5對炎性細胞的影響及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用

炎癥反應(yīng)一般表現(xiàn)為組織周圍間質(zhì)中有許多炎性細胞的聚集，也被稱為炎性細胞浸潤。通過對小鼠BALF 中總炎性細胞及各種炎性細胞的計數(shù)可以觀測到PM2.5對小鼠肺組織造成的炎癥反應(yīng)以及不同濃度的蛹蟲草對炎癥反應(yīng)的抑制作用[11]。各組小鼠BALF中總細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞數(shù)目見表1。

表1 各組小鼠BALF 中總細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞數(shù)目Table 1 Counts of total cell，lymphocyte，neutrophil,and eosinophil in bronchoalveolar lavage fluid of mice

與正常組小鼠相比，PM2.5染毒組BALF 中總細胞密度、淋巴細胞密度、中性粒細胞密度、嗜酸性粒細胞密度均顯著升高（P＜0.05），表明PM2.5可增加小鼠炎性細胞數(shù)量。與PM2.5染毒組相比，蛹蟲草提取物干預(yù)組BALF 中總細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞密度明顯降低（P＜0.05）且隨蛹蟲草提取物濃度增加炎性細胞密度降低更明顯，結(jié)果提示蛹蟲草提取物可以減輕PM2.5致肺損傷小鼠炎性損傷，減少炎性細胞募集。

2.1.2 PM2.5對小鼠 BALF 中 LDH、AKP 和 ACP 活性的影響及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用

LDH 是一種糖酵解酶，催化乳酸脫氫生成丙酮酸它在機體內(nèi)組織細胞內(nèi)含量十分豐富。ACP 主要在巨噬細胞在出現(xiàn)，是一種溶酶體酶。當細胞膜受損后，細胞膜通透性降低，LDH 和ACP 會大量釋放到胞外，致使其活力增加，所以LDH 和ACP 含量可以作為細胞膜受損程度的指標[12]。AKP 的活性增加主要是反映了肺泡Ⅱ型細胞的損傷程度[13]。表2 為各組小鼠BALF中LDH、AKP 和 ACP 活性。

由表2 可知，與正常組相比，PM2.5染毒可引起小鼠 LDH、AKP 和 ACP 活力顯著升高（P＜0.05），結(jié)果提示PM2.5可導(dǎo)致肺泡細胞膜損壞，膜通透性改變，使肺實質(zhì)細胞損傷；相比于PM2.5染毒組，其各自的蛹蟲草提取物干預(yù)組中LDH、AKP 和 ACP 活力顯著降低（P＜0.05）。由此說明，蛹蟲草提取物對PM2.5致小鼠肺損傷有減輕作用，能夠緩解PM2.5對肺實質(zhì)細胞的損傷，維持細胞膜的通透性。

表2 各組小鼠BALF 中LDH、AKP 和ACP 活性Table 2 Activities of LDH，AKP，and ACP in bronchoalveolar lavage fluid of mice

2.2 PM2.5 對血清免疫球蛋白和細胞因子的影響及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用

2.2.1 PM2.5對TNF-α 的影響及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用

TNF-α 可以激活單核巨噬細胞、中性粒細胞、血管內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致炎癥因子大量釋放，造成炎性組織損傷，是炎癥反應(yīng)中最早出現(xiàn)的炎性因子，是反映細胞炎性作用程度的指標[14]。PM2.5對小鼠血清TNF-α 水平的影響及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用見圖1。

圖1 各組小鼠血清TNF-α 含量Fig.1 Levels of serum TNF-α in different groups mice

由圖1 可知，與正常組相比，PM2.5染毒組TNF-α含量顯著升高（P＜0.05）；與 PM2.5染毒組相比，蛹蟲草提取物干預(yù)組肺組織中TNF-α 含量均顯著降低（P＜0.05）。表明蛹蟲草提取物能夠減輕PM2.5誘導(dǎo)促炎性因子TNF-α 的釋放。

2.2.2 PM2.5 對IL-6 的影響及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用

IL-6 主要由巨噬細胞、淋巴細胞等多種細胞產(chǎn)生，具有炎癥放大作用，同時IL-6 可激活中性粒細胞[15]，小鼠血清中IL-6 水平可反映PM2.5對小鼠肺組織細胞的炎性損傷程度以及各劑量蛹蟲草的保護作用。PM2.5對小鼠血清IL-6 水平的影響及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用見圖2。

圖2 各組小鼠血清IL-6 含量Fig.2 Levels of serum IL-6 in different groups mice

由圖2 可知，與正常組比較，PM2.5染毒組IL-6 含量急劇升高（P＜0.05），表明 IL-6 是 PM2.5引發(fā)小鼠肺部炎性的敏感指標。與PM2.5染毒組相比，蛹蟲草提取物干預(yù)組血清中IL-6 含量顯著降低（P＜0.05），表明蛹蟲草提取物在一定程度上能夠減弱PM2.5誘導(dǎo)的促炎因子IL-6 水平增加，對PM2.5致肺組織炎癥損傷有一定減輕作用。

2.2.3 PM2.5對免疫球蛋白的影響及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用

免疫球蛋白是具有抗體活性或與抗體分子相似的球蛋白。在血清中，免疫球蛋白中有3 類較多，它們分別是IgA、IgG、IgM。IgA 在血清中多為單體，它可以促進吞噬抗體依賴細胞介導(dǎo)的毒性作用。IgG 是血清中含量最多的免疫球蛋白，大多數(shù)的抗病毒抗體都是IgG，它可以促進單核細胞的調(diào)理作用還能中和細胞毒素及病毒[16]。IgM 是分子量最大的免疫球蛋白，它具有很強的抗原結(jié)合能力，在免疫反應(yīng)過程中是最先出現(xiàn)的。血清中免疫球蛋白越低，表明小鼠的免疫能力降低。通過測量不同組鼠血清中免疫球蛋白的含量可以觀測PM2.5對小鼠免疫能力的影響以及蛹蟲草對其的干預(yù)作用。各組小組血清IgA、IgG 和IgM 水平見表3。

表3 各組小組血清IgA、IgG 和IgM 水平Table 3 Levels of serum IgA，IgG，and IgM in different groups mice

表3 結(jié)果表明，與正常組相比，PM2.5染毒組血清中 IgA、IgG 和 IgM 顯著降低（P ＜ 0.05）。與染毒組相比，蛹蟲草提取物干預(yù)組血清中IgA、IgG 和IgM 水平顯著提高（P ＜0.05）。表明蛹蟲草提取物在一定程度上能夠減弱PM2.5導(dǎo)致的免疫球蛋白水平下降。

2.3 PM2.5 對小鼠肺組織的氧化損傷作用及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用

2.3.1 PM2.5對小鼠肺組織MDA 含量影響及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用

MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，MDA 含量可反映脂質(zhì)過氧化的程度[17]，通過測定MDA 可以了解到PM2.5暴露是否造成機體脂質(zhì)氧化損傷。PM2.5對小鼠肺組織MDA含量影響及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用如圖3 所示。

由圖可知，PM2.5染毒組的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著高于正常組（P＜0.05），表明PM2.5暴露可導(dǎo)致脂質(zhì)氧化損傷；蛹蟲草提取物各劑量組的MDA 含量均顯著低于PM2.5染毒組（P＜0.05）。由此可以得出蛹蟲草提取物干預(yù)組劑量越高，MDA 下降的程度越高。表明蛹蟲草提取物在一定程度上能夠減弱PM2.5導(dǎo)致的脂質(zhì)氧化損傷。

2.3.2 PM2.5對小鼠肺組織 T-AOC、SOD、CAT、GSHPX 活性影響及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用

圖3 各組小鼠肺組織MDA 含量Fig.3 Levels of MDA in in different groups mice

PM2.5可刺激機體產(chǎn)生大量的活性氧和活性氮自由基，過量自由基使機體抗氧化酶耗竭或活性下降[18]，抗氧化酶活性的高低可反映機體受PM2.5氧化損傷的程度。T-AOC 可反映組織中的總抗氧化能力；SOD 能夠消除生物體內(nèi)的有害物質(zhì)達到清除作用；CAT 主要存在于動植物體內(nèi)，它可以催化體內(nèi)過氧化氫分解從而防止細胞氧化；GSH-PX 可以清除脂質(zhì)過化物，是一種重要的過氧化物分解酶，可以保護細胞膜的結(jié)構(gòu)和完整[19]。PM2.5對小鼠肺組織的 T-AOC、SOD、CAT、GSHPX 活性影響及蛹蟲草提取物的干預(yù)作用如表4 所示。

表4 蛹蟲草提取物對PM2.5 致小鼠肺組織T-AOC、SOD、CAT 和GSH-Px 活性Table 4 Activities of T-AOC，SOD，CAT，and GSH-Px in lung of mice

由表4 可知，PM2.5染毒組小鼠肺組織T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX 活性均顯著低于正常組（P＜0.05），表明PM2.5對小鼠肺組織抗氧化防御系統(tǒng)造成了損傷。蛹蟲草提取物各劑量組小鼠肺組織中T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px 活性顯著高于模型組（P＜0.05），結(jié)果提示蛹蟲草提取物在一定程度上能夠緩解PM2.5對小鼠肺組織氧化損傷作用。

3 結(jié)論

蛹蟲草提取物能夠減弱PM2.5染毒致小鼠體質(zhì)量的下降。PM2.5染毒能夠造成小鼠肺泡灌洗液中淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞等炎性細胞密度增加，蛹蟲草提取物可以抑制這種現(xiàn)象。PM2.5染毒后，肺泡灌洗液中ACP、AKP、LDH 活性升高，不同劑量蛹蟲草提取物均可以抑制其增加，并隨濃度增加而效果愈加。不同劑量蛹蟲草提取物可顯著減弱PM2.5染毒引起的血清中IL-6 和TNF-α 促炎因子水平的上升，減弱IgA、IgM 和IgG 等免疫球蛋白水平的下降。PM2.5染毒后，小鼠肺組織勻漿上清液 T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX 活性降低，MDA 含量升高，蛹蟲草提取物干預(yù)可以抑制上述改變。綜上所述，PM2.5可對小鼠肺組織造成顯著的炎性損傷和氧化損傷，蛹蟲草提取物能夠減輕上述損傷作用，其保護機理與其抗氧化和抗炎活性相關(guān)。