DNMT1抑制劑DC_517對膠質瘤細胞增殖和侵襲的影響

徐雅娣，趙 兵，卞爾保，紀興虎，楊志豪，湯 鋒，萬經海

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，術后易復發，患者術后常需輔以放療及化療[1-2]。DNA甲基化是一種由甲基化轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)介導的化學修飾，與膠質瘤的發生、發展密切相關[3]。因此，抑制DNA甲基化轉移酶的功能可能作為治療膠質瘤的靶點。近年來，DNMT抑制劑在臨床試驗中得到充分驗證，如阿扎胞苷聯合替莫唑胺可抑制IDH突變型膠質瘤的增殖[4]。DC_517是一種新的DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase-1，DNMT1)抑制劑，研究[5]顯示，DC_517可顯著抑制腫瘤細胞的增殖,但其在膠質瘤中的作用尚未可知。該文以人腦膠質瘤細胞LN18細胞系作為研究對象，探討DC_517對LN18細胞系的增殖、遷移侵襲能力的影響及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器DC_517購自美國MedChemExpress (MCE)公司；胎牛血清購自美國Gbico公司；胰蛋白酶、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)購自上海碧云天科技公司；山羊抗兔、山羊抗鼠抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；高糖培養基(DMEM)購于美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自上海貝博生物有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；基質膠購自美國BD公司；β-actin、增殖相關蛋白增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA) 和G1/S-特異性周期蛋白-D1 (G1/S-specific cyclin-D1，Cyclin D1)等抗體購自美國Abcam公司；基質金屬蛋白酶-9 ( matrix metalloproteinase-9，MMP9)抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；TS100型倒置顯微鏡購自日本Nikon公司；超凈工作臺購自蘇州凈化設備公司；ST-360酶標儀器購自上海科華實驗系統有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人腦膠質瘤LN18細胞購自上海中科院。細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱內培養。在顯微鏡下觀察到細胞匯合率達到80%以上，即進行細胞傳代。當細胞處于對數生長期時用于實驗。

1.2.2CCK-8法檢測DC_517對腦LN18膠質瘤細胞增殖的影響 取處于對數生長期的細胞，用胰蛋白酶消化并制成細胞懸液。每孔按4×103個接種至96孔板中，每組設置6個復孔，置于細胞培養箱中培養，待細胞貼壁后加入相應濃度的DC_517，繼續培養至相應時間后，棄去含藥培養基，每孔加入新鮮配制的含10 μl CCK-8溶液的培養基，置于培養箱中繼續培養4 h后，在酶標儀上選擇 450 nm 波長測定各組細胞吸光度(OD)值。實驗重復3次，取實驗結果的平均值作為最終實驗結果。按公式計算細胞存活率=[(實驗組OD值-空白組OD值)]/[(對照組OD值-空白組OD值)]×100%，以分組為橫坐標，細胞存活率為縱坐標，繪制柱狀圖。

1.2.3細胞遷移、侵襲實驗 取經不同濃度DC_517處理不同時間后的細胞，胰蛋白酶消化后用培養基重懸。調整細胞密度至1×105～10×105個/ml，加入事先處理好的Transwell小室，遷移實驗每孔加入1×104個細胞，侵襲實驗每孔加入7×104個細胞，24孔板下室加入500 μl含10%胎牛血清的培養基，注意不要產生氣泡。培養箱分別培養24 h、48 h后，對附著在小室底部膜下側的細胞用4%多聚甲醛固定后結晶紫染色，顯微鏡下拍照并計數細胞。

1.2.4蛋白免疫印跡實驗 將DC_517處理好的細胞提取蛋白，并根據BCA法測定蛋白濃度，以蛋白體積 ∶5×SDS上樣緩沖液體積=1 ∶4的比例加入蛋白上樣緩沖液后100 ℃煮沸10 min。制備凝膠，加入等量的蛋白樣品，每組加2組復孔。開始電泳，先80 V 電泳30 min,待電泳至分離膠時，改為120 V繼續電泳60 min。電泳完成后切膠，切下目的蛋白，根據所切膠的大小，將PVDF膜用剪刀剪出比膠面積略大的PVDF膜，甲醇激活后敷在膠上，注意不要產生氣泡。將膠置于轉膜夾子中夾緊，轉膜槽中轉膜，時間根據目的蛋白分子量大小調整。轉膜完成后，用5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗5 min×5次，膜置于相應一抗中4 ℃過夜。第2天TBST洗5 min×5次后，用辣根過氧化物酶標記的相應二抗孵育約1 h，繼續TBST洗5 min×5次，最后顯影儀下進行化學發光檢測，得到相應蛋白條帶。

2 結果

2.1 DC_517加藥處理后對LN18細胞增殖的影響與對照組比較，用濃度為1 μmol/L的DC_517作用于LN18細胞48 h后，細胞相對存活率明顯下降，差異有統計學意義(F=6.714，P<0.05)，而作用24 h后效果不明顯(F=6.714，P>0.05)，見圖1A。用不同濃度DC_517(濃度分別為0、1、5 μmol/L)處理LN18細胞48 h后，CCK-8法檢測結果顯示DC_517對細胞增殖的抑制率呈現濃度依賴性(F=45.078,P<0.01)，見圖1B。

圖1 不同濃度DC_517處理LN18細胞不同時間后對細胞增殖及DC_517對LN18細胞增殖的影響

A： 1 μmol/L DC_517處理LN18細胞后對細胞增殖的影響；1: 0 h-1 μmol/L組;2: 24 h-1 μmol/L組;3: 48 h-1 μmol/L組; 與0 h-1 μmol/L組比較：*P<0.05; B: DC_517處理LN18細胞48 h后對細胞增殖的影響； 4: 48 h-0 μmol/L組;5: 48 h-1 μmol/L組;6: 48 h-5 μmol/L組; 與48 h-0 μmol/L組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.2 DC_517加藥處理后對LN18細胞增殖相關蛋白表達的影響如圖2A，用濃度為1 μmol/L的DC_517作用于LN18細胞，與對照組比較，PCNA和Cyclin D1相對表達量在作用48 h后降低，差異有統計學意義(F=13.520、F=96.005，P<0.01)；作用24 h后，Cyclin D1蛋白相對表達量降低，而PCNA蛋白相對表達量無明顯變化(F=96.005，P<0.05；F=13.520，P>0.05)。如圖2B，用不同濃度DC_517處理LN18細胞48 h后，各DC_517處理組PCNA和Cyclin D1 蛋白表達水平顯著低于對照組(F=170.010、F=79.676，P<0.01)，且隨DC_517濃度的升高，兩種蛋白的表達水平相應降低。

2.3 DC_517加藥處理后對LN18細胞遷移、侵襲力的影響如圖3A所示，用濃度為1 μmol/L的DC_517分別作用于LN18細胞0 h、24 h、48 h，與對照組比較，DC_517作用24 h后細胞遷移數未見明顯減少，而作用48 h后，細胞遷移數明顯減少(F=27.952,P>0.05；F=27.952,P<0.01)。用不同濃度DC_517處理LN18細胞48 h后，與對照組比較，各DC_517處理組細胞遷移數減少，且細胞遷移數隨著DC_517濃度升高而減少(F=93.278，P<0.01)，見圖3B。除此之外，DC_517對LN18細胞侵襲力的影響呈現出與其對細胞遷移相似的結果(F=22.013，P>0.05；F=22.013，P<0.01；F=37.597，P<0.01)，見圖4。

圖2 DC_517對LN18細胞增殖相關蛋白的影響

A： 1 μmol/L DC_517處理LN18細胞后對增殖相關蛋白的影響；1: 0 h-1 μmol/L組;2: 24 h-1 μmol/L組;3: 48 h-1 μmol/L組; 與0 h-1 μmol/L組比較：*P<0.05，**P<0.01; B: DC_517處理LN18細胞48 h后對增殖相關蛋白的影響；4: 48 h-0 μmol/L組;5: 48 h-1 μmol/L組;6: 48 h-5 μmol/L組; 與48 h-0 μmol/L組比較：##P<0.01

圖3 DC_517對LN18細胞遷移的影響 ×100

A： 1 μmol/L DC_517處理LN18細胞后對細胞遷移的影響；A1: 0 h-1 μmol/L組;A2: 24 h-1 μmol/L組;A3: 48 h-1 μmol/L組; A4：各組直方圖；與0 h-1 μmol/L組比較：**P<0.01; B: DC_517處理LN18細胞48 h后對細胞遷移的影響；B1: 48 h-0 μmol/L組;B2: 48 h-1 μmol/L組;B3: 48 h-5 μmol/L組; B4：各組直方圖；與48 h-0 μmol/L組比較：##P<0.01

2.4 DC_517加藥處理后對LN18細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的影響用濃度為1 μmol/L的DC_517作用于LN18細胞，與對照組比較，遷移侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶-9(MMP9)蛋白相對表達量在作用24 h后未見明顯變化，而在作用48 h后相對表達量明顯降低(F=15.202，P>0.05，F=15.202，P<0.01)，見圖5A。用不同濃度DC_517處理LN18細胞48 h后，與對照組比較，濃度為1 μmol/L和5 μmol/L組MMP9蛋白表達水平降低，且隨著DC_517濃度升高，MMP9蛋白表達水平逐漸降低(F=67.840，P<0.01)。

圖4 DC_517對LN18細胞侵襲的影響 ×100

A： 1 μmol/L DC_517處理LN18細胞后對細胞侵襲的影響；A1: 0 h-1 μmol/L組;A2: 24 h-1 μmol/L組;A3: 48 h-1 μmol/L組；A4：各組直方圖；與0 h-1 μmol/L組比較：**P<0.01; B: DC_517處理LN18細胞48 h后對細胞侵襲的影響；B1: 48 h-0 μmol/L組;B2: 48 h-1 μmol/L組;B3: 48 h-5 μmol/L組；B4：各組直方圖；與48 h-0 μmol/L組比較：##P<0.01

圖5 DC_517對LN18細胞遷移侵襲相關蛋白的影響

A： 1 μmol/L DC_517處理LN18細胞后對遷移侵襲相關蛋白的影響；1: 0 h-1 μmol/L組;2: 24 h-1 μmol/L組;3: 48 h-1 μmol/L組; 與0 h-1 μmol/L組比較：**P<0.01; B: DC_517處理LN18細胞48 h后對遷移侵襲相關蛋白的影響；4: 48 h-0 μmol/L組;5: 48 h-1 μmol/L組;6: 48 h-5 μmol/L組; 與48 h-0 μmol/L組比較：##P<0.01

3 討論

惡性膠質瘤是最常見和最致命的原發性惡性腦腫瘤，亟需有效的治療[6]。目前膠質瘤的治療仍以手術切除為主，輔以放射治療及化學治療，主要的化療藥物為替莫唑胺，但部分患者的化療效果并不理想，文獻[4,7]報道替莫唑胺聯合DNMTs抑制劑阿扎胞苷可抑制IDH突變型膠質瘤的增殖，表明DNMTs抑制劑可能作為一種新的化療輔助藥物。

DNA甲基化是指在DNMTs的催化下，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶(5mC)的一種反應，研究表明異常的DNA甲基化可以調控膠質瘤的發生、發展[3]。 DNMTs在DNA甲基化中發揮關鍵的催化作用，其主要包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，其中DNMT1是最早被研究且研究范圍最廣的DNA甲基轉移酶[8]。大量的研究[5,9-11]表明，DNMTs抑制劑可通過抑制DNMTs的功能進而抑制異常的DNA甲基化發生，最終抑制腫瘤的進展。本課題組的前期研究[9]發現，DNA甲基轉移酶抑制劑5-AZA可以特異性抑制DNMT1活性，抑制異常的甲基化發生，激活沉默的抑癌基因DOK7，逆轉膠質瘤細胞的生物學特征。據報道DNMTs抑制劑zebularine可抑制肝癌細胞的增殖[10]。此外，Borges et al[11]報道DNMT抑制劑可以降低乳腺癌細胞的侵襲力。DC_517是一種新的DNMT1抑制劑，并可顯著抑制腫瘤細胞的增殖[5]。本實驗研究表明用不同濃度的DC_517處理LN18細胞48 h后，DC_517抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移侵襲能力的作用隨其濃度的增加而增強。此外用DC_517處理LN18細胞48 h后，DC_517可通過抑制增殖相關蛋白PCNA、CyclinD1表達進而顯著抑制膠質瘤細胞的增殖，通過抑制遷移侵襲相關蛋白MMP9表達進而抑制膠質瘤細胞的遷移侵襲。以上結果表明DNMT1抑制劑DC_517可通過抑制增殖相關蛋白PCNA、CyclinD1和侵襲相關蛋白MMP9的表達分別抑制LN18膠質瘤細胞的增殖和侵襲。

目前國內外已經報道的DNMTs抑制劑主要分為核苷類似物和非核苷類似物，核苷類代表藥物主要有地西他濱和阿扎胞苷；非核苷類主要包括普魯卡因、普魯卡因胺、肼屈嗪和米托蒽[12-13]。核苷類似物具有化合物不穩定、細胞毒性大、副作用大等缺點，而非核苷類似物由于不破壞細胞RNA結構，結構穩定，特異性強，具有更廣闊的臨床應用前景,而本實驗所用的DNMT1抑制劑DC_517即屬于非核苷類似物類[5,14]。近年來，DNMTs抑制劑在臨床試驗中也得到充分驗證，如阿扎胞苷可用于治療骨髓增生異常綜合征(MDS)和急性髓細胞白血病，說明抑制DNMTs的功能可能成為治療腫瘤的靶點[15]。本實驗的研究結果表明，非核苷類似物類DNMT1特異性抑制劑DC_517可顯著抑制膠質瘤LN18細胞的增殖和侵襲，為臨床膠質瘤的化療提供一定的借鑒。