KSHV K15P及其突變體的慢病毒包裝與穩定細胞株的篩選及其對內皮細胞增殖遷移的影響

周 暢，許常青，許方瑋，方 圓，陳 偉，文 志，林 康，王林定

卡波肉瘤(Kapos’s sarcoma，KS)是一種罕見的腫瘤，其特征是廣泛的新生血管生成、炎性細胞浸潤和內皮來源的非典型分化梭形細胞。KS是由一種致癌的γ皰疹病毒卡波肉瘤相關皰疹病毒(Kapos sarcoma associated herpesvirus，KSHV)又稱人皰疹病毒-8(human herpes virus-8，HHV-8)引起的。KSHV于1994年由華裔科學家Chang et al[1]在KS組織中發現該病毒。除KS之外它與原發滲液性淋巴瘤(primary effusion lymphoma，PEL)和多中心性卡斯爾曼病(multicentric Castleman disease，MCD)有關[2]。K15P基因位于病毒基因組的右末端，編碼一個最多12次跨膜結構域和一個具有多個保守信號基序的羧基端細胞質尾部[3]。將其中一個信號基序YEEVL位點中的Y位點突變為F將導致其激活信號通路的效率降低，突變體被命名為K15P(YF)[4]。相關研究[5]顯示，K15P參與KS的發生發展，尤其在腫瘤的血管新生方面起到重要作用。本研究通過第三代慢病毒包裝體系包裝慢病毒，獲得高效表達K15P與K15P(YF)的慢病毒，并獲得穩定表達K15P與K15P(YF)的內皮細胞EA.hy926，旨在為研究K15P在內皮細胞內的功能及KSHV在血管新生方面的機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源HEK293T細胞、EA.hy926細胞及5種質粒：pFJ-K15P、pFJ-K15P(YF)、pHAGE-CMV-MCS-Puro、PSPAX2和pMD2.g均由本實驗室保存，其中pFJ-K15P、pFJ-K15P(YF)重組質粒包含有K15P、K15P(YF)的全部8個外顯子序列，T-Vector購自北京TaKaRa公司。HEK293T細胞培養于含有10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的高糖DMEM(美國hyclone公司)培養基中，EA.hy926細胞培養于含有10%胎牛血清、100 μg /ml鏈霉素和100 U /ml青霉素的RPMI-1640(美國hyclone公司)培養基中。

1.2 主要試劑限制性內切酶Not I、BamH I、PCR Amplification試劑盒、Mighty TA-cloning試劑盒和DL10000 DNA Marker(北京TaKaRa公司)；質粒小提試劑盒(中量)、核酸凝膠純化試劑盒( 北京天根有限公司)；Opti-MEM(美國Gibco公司); Lip2000(美國Invitrogen公司)；兔anti-FLAG多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；山羊抗兔IgG二抗(北京博奧森公司)；嘌呤霉素粉末(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 構建pHAGE-CMV-MCS-K15P-Puro、pHAGE-CMV-MCS -K15P(YF)-Puro重組質粒及鑒定

1.3.1K15P、K15P(YF)基因的擴增 根據NCBI上K15P基因序列，引物設計合成由滁州通用生物科技有限公司完成，F：5′-TTGCGGCCGCGCCACCATGAAGACACTCATA-3′(下劃線部分代表Not I的酶切位點)；R：5′-TTGGATCCTTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGTTCCTGGGAAATAA-3′(下劃線部分代表BamH I的酶切位點)。以實驗室保存質粒pFJ-K15P、pFJ-K15P(YF)為模板，使用PCR技術對目的基因擴增。反應體系共50 μl，包括pFJ-K15P或pFJ-K15P(YF)質粒模板2 μl、PCR Premix 25 μl、ddH2O 19 μl、上游引物2 μl、下游引物2 μl。K15P反應體系：預變性95 ℃、3 min，變性95 ℃、20 s；退火60 ℃、20 s，延伸72 ℃、2 min，持續變性至延伸共35個循環；之后72 ℃、10 min；K15P(YF)反應體系：預變性95 ℃、3 min，變性95 ℃、20 s；退火55 ℃、20 s，延伸72 ℃、2 min，持續變性至延伸共35個循環；之后72 ℃、10 min。1%瓊脂糖電泳PCR產物，切膠回收目的條帶并測定其濃度，TA克隆至T載體，藍白斑挑選白色菌落，搖菌12 h后提取質粒，酶切初步鑒定，并送至滁州通用生物科技有限公司進行測序。

1.3.2重組質粒的構建及鑒定 用Not I和BamH I雙酶切pHAGE-CMV-MCS -Puro質粒，37 ℃、2 h，切膠回收，測定濃度。通過DNA連接酶DNA Ligation(北京TaKaRa公司)將PCR回收的K15P和K15P(YF)分別連接至線性化的pHAGE-CMV-MCS -Puro載體上并轉化DH5α感受態細胞。轉化后的感受態細胞均勻涂布于含有異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)、X-Gal的平板中，20 h后挑取陽性克隆，擴增菌液后提取質粒，酶切鑒定，并送至滁州通用生物科技有限公司進行測序。

1.4 慢病毒的包裝轉染前1 d，胰酶消化HEK 293T細胞，密度調整為1×106個/ml，接種于100 mm細胞培養皿，24 h待細胞匯合度達到70%～90% 時即可進行轉染。在轉染前2 h，吸棄原有的培養基，換為新鮮無雙抗無血清的DMEM培養基。1.5 ml滅菌離心管中加入500 μl Opti-MEM培養基，其中依次加入8 μg pHAGE-CMV-MCS-K15P-Puro或pHAGE-CMV-MCS-K15P(YF)-Puro、 6 μg PSPAX2、 3 μg pMD2.g 輕柔混勻，室溫靜置5 min。另取一支新的1.5 ml滅菌離心管加入500 μl Opti-MEM培養基，加入34 μl Lip2000并輕柔混勻。將上述兩管溶液混勻后室溫靜置15～30 min即為轉染復合物。15～30 min后將轉染復合物混勻后加入細胞上清液中，緩慢混勻復合物與細胞培養基使分布均勻。轉染6 h后觀察細胞狀態并棄去培養基換成10 ml新鮮的完全培養基。細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養48 h后收集細胞上清液，4 ℃、3 000 r/min離心10 min去除細胞碎片，0.45 μm針式濾器過濾，收集后置于4 ℃冰箱保存，可直接用于后續的感染實驗。

1.5 內皮細胞的感染與篩選

1.5.1感染內皮細胞 將EA.hy926細胞鋪于24孔板中，待細胞匯合度達到80%后，每孔加入500 μl病毒上清液與8 μg/ml Polybrene，感染4 h后棄去上清液，加入500 μl新鮮不含抗生素的完全培養基，24 h后傳代。

1.5.2穩定株的篩選 將EA.hy926細胞鋪于24孔板中，待細胞匯合度達到70%后，每孔細胞加入終濃度1 μg/ml的嘌呤霉素，同時增加不使用病毒感染的野生型細胞，加入嘌呤霉素，條件與實驗組相同。每24 h觀察細胞狀態，直至不感染病毒的對照組細胞被嘌呤霉素全部殺死。

1.6 Western blot 檢測K15P 、K15P(YF)蛋白的表達將篩選后的細胞裂解、離心取上清液加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃金屬浴加熱10 min，12%的SDS-PAGE電泳，電轉至0.45 μm的PVDF膜后，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，1 ∶200稀釋兔抗FLAG多克隆抗體一抗，4 ℃滾動孵育過夜。次日PBST洗膜3次，1 ∶5 000稀釋辣根標記山羊抗兔的二抗，室溫孵育2 h，PBST洗膜3次后曝光顯影。

1.7 內皮細胞遷移實驗使用基質膠包被8 μm孔徑Transwell多孔膜上側，置于超凈臺中30 min使基質膠凝固。使用前30 min加入新鮮培養基使小室多孔膜水化。消化細胞鋪板或加入Transwell之前讓其在無血清培養基環境中饑餓細胞3 h，消除血清對細胞的影響。消化重懸EA.hy926細胞，調整細胞密度至5×105/ml。取100 μl細胞懸液加入Transwell小室上室中，24孔板下室加入600 μl含20%FBS，1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基培養12～48 h。取出Transwell小室，棄去小室中培養基，DPBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，使用0.1%結晶紫染色20 min，棉簽輕輕擦拭小室上層未遷移細胞避免對觀察產生干擾，DPBS洗3遍，每個Transwell置于400倍顯微鏡下選取隨機5個區域，進行計數。

1.8 CCK-8細胞增殖活性實驗將感染了空載體慢病毒，Lenti-K15P和Lenti-K15P(YF)慢病毒的EA.hy 926細胞，分別在96孔板中鋪板。每孔約種2×103個細胞。12 h后待其貼壁，棄去原有培養基，加入新鮮的培養基與10 μl /孔的CCK-8試劑，5%CO2、37 ℃培養4 h后，酶標儀檢測吸光度。

2 結果

2.1 重組慢病毒載體的構建與鑒定以重組質粒pFJ-K15P、pFJ-K15P(YF)為模板，設計合成相應引物，通過PCR擴增目的基因片段K15P、K15P(YF)，在約1 500 bp位置可觀察到目的條帶的出現，見圖1A。通過TA克隆將擴增片段連接至T載體上。經Not I和BamH I雙酶切后出現線性化的T載體和K15P或K15P(YF)兩條帶，大小分別為2 692 bp和1 470 bp，見圖1B。T載體酶切回收的目的基因片段構建至表達載體pHAGE-CMV-MCS-Puro后，Not I和BamH I雙酶切出現線性化的pHAGE-CMV-MCS-Puro載體和K15P或K15P(YF)兩條帶，大小分別為7 742 bp和1 470 bp，見圖1C。對重組慢病毒質粒進行測序，與GenBank中的K15P、K15P(YF)序列比較，結果一致，證明已成功構建重組質粒。

圖1 K15P、K15P(YF)基因慢病毒表達載體構建的酶切鑒定

A：K15P、K15P(YF)基因PCR擴增圖；B：T載體酶切鑒定圖；C：慢病毒表達載體酶切鑒定圖；M：DNA Marker；1、2：PCR擴增產物K15P、K15P(YF)基因；3、4：重組T載體質粒T-K15P、T-K15P(YF)；5、6：重組T載體質粒T-K15P、T-K15P(YF)酶切；7、8：重組慢病毒表達載體質粒pCDH-CMV-K15P-Puro、pCDH-CMV-K15P(YF)-Puro；9、10：重組慢病毒表達載體質粒pCDH-CMV-K15P-Puro、pCDH-CMV-K15P(YF)-Puro酶切

圖2 K15P、K15P(YF)表達株的篩選 ×400

A：野生型EA.hy926細胞在1 μg/ml嘌呤霉素生長狀態；B：K15P(YF)組EA.hy926細胞在1 μg/ml嘌呤霉素生長狀態；C：K15P組EA.hy926細胞在1 μg/ml嘌呤霉素生長24、36、72 h狀態；1：24 h；2：36 h；3：72 h

2.2 內皮細胞的感染與篩選感染24 h后，將EA.hy926細胞鋪板，換上含1 μg/ml嘌呤霉素的新鮮完全培養液，篩選穩定表達目的蛋白的細胞株。72 h后未經病毒感染的野生型細胞全部死亡，而K15P與K15P(YF)組細胞狀態良好。將感染并篩選后的EA.hy926細胞傳代，繼續加入嘌呤霉素進行維持性篩選培養。見圖2。

2.3 慢病毒感染EA.hy926細胞后K15P 、K15P(YF)蛋白的檢測將野生組和慢病毒組細胞裂解，提取總蛋白，Western blot檢測到了慢病毒組細胞K15P、K15P(YF)蛋白的表達。見圖3。

圖3 Western blot 檢測EA.hy926細胞中K15P、K15P(YF)蛋白的表達

A：空載體對照組病毒所感染細胞；B：K15P慢病毒組病毒所感染細胞；C：K15P(YF)慢病毒組病毒所感染細胞

2.4 K15P促進內皮細胞EA.hy 926增殖和遷移使用表達K15P、K15P (YF)蛋白的EA.hy926細胞與空載體包裝的慢病毒感染的EA.hy926細胞進行Transwell遷移實驗與CCK8增殖活性實驗。Transwell遷移實驗顯示，三組細胞遷移量差異有統計學意義(F=113.5，P<0.01)，與空載體組和K15P(YF)組(0.98±0.23)比較，K15P組(2.25±0.15)的EA.hy926細胞的遷移能力明顯增強(P<0.01)。CCK8增殖活性實驗顯示，三組細胞增殖活性差異有統計學意義(F=40.78，P<0.01)，與空載體組和K15P (YF)組(109.23±12.58)比較，K15P組(138.69±7.47)的EA.hy926細胞的增殖能力明顯增強(P<0.01)。見圖4。

3 討論

KSHV又稱HHV-8，于1994年首次在KS組織中發現，KSHV的基因組結構與猴皰疹病毒相似，屬于γ皰疹病毒亞科。KSHV與KS發生密切相關。KS有地域型、經典型、移植型和AIDS相關型4種不同的類型，4種類型的KS組織中含有相同的梭形細胞，這種內皮來源的梭形細胞具有增殖作用，是KS形成的主要因素[6]。我國KS類型為經典型，西北地區KS發病率較高，而在其他區域發病較罕見[7-8]。

K15主要有兩種等位基因：P和M[9]，兩者存在65%的保守區域，KS病例中主要是P型。K15P基因位于病毒基因組的右端，編碼一個最多12次跨膜結構域和一個具有多個保守信號基序的羧基端細胞質尾部[10]。羧基端細胞質尾部包括兩個SH2結合位點(VFGYASI和DDLYEEV)[11]，一個富含脯氨酸的SH3結合位點和一個TRAF結合位點[12]。K15P通過激活JNK、ERK、MAPK等信號通路來促進KSHV介導的血管生成[13-15]。DDLYEEV結合位點的酪氨酸突變為苯丙氨酸(K15P(YF))會導致K15P介導的下游信號受損。

圖4 K15P促進內皮細胞EA.hy 926的增殖和遷移 ×400

A：Transwell遷移實驗空載體病毒感染的EA.hy926細胞遷移；B：Transwell遷移實驗表達K15P(YF)蛋白的EA.hy926細胞遷移；C：Transwell遷移實驗表達K15P蛋白的EA.hy926細胞的遷移；D：Transwell遷移實驗數據分析；E：CCK-8細胞增殖實驗檢測三組細胞的增殖活性；與空載體組比較：**P<0.01；與突變體組比較：##P< 0.01

使用慢病毒感染與普通的脂質體轉染方法相比，其操作復雜周期長，但慢病毒可以將目的基因整合到目的細胞基因組中。此外內皮細胞本身就是KSHV的靶細胞，普通的脂質體轉染法難以使內皮細胞表達K15P，為了研究K15P在內皮細胞中的機制，采用了慢病毒包裝的方式使內皮細胞表達K15P。本實驗構建含有K15P、K15P(YF)基因片段的慢病毒表達載體，成功建立可以高效表達K15P蛋白及其突變體的第三代慢病毒系統。通過使用包裝獲得的病毒顆粒成功感染EA.hy926細胞，嘌呤霉素篩選得到具有嘌呤霉素抗性的細胞株，Western blot 檢測到EA.hy926細胞內表達的K15P及其突變體K15P(YF)蛋白。Transwell與CCK8實驗也證實K15P蛋白促進了細胞增殖遷移，預示K15P蛋白可能在KS的發生發展中發揮重要作用，為研究K15P蛋白在內皮細胞的功能與KSHV的致病機制奠定了一定的實驗基礎。