滅活處理雞新城疫疫苗替代流感病毒血凝及血凝抑制實驗教學效果分析

胡 濤，張文昌，程正陽，李 群，王明麗

血凝(hemagglutination assay，HA)和血凝抑制(hemagglutination inhibition assay，HI)試驗是目前我國對流感和禽流感等病毒性疾病進行流行病學調查、疫病診斷、防疫檢測和免疫程序制定等工作進行檢測和監測的主要試驗技術，是醫學微生物學實驗課教學中本科生和研究生的常規性操作內容[1]。由于流感病毒屬于生物安全第二類病原微生物，具有較高的生物危害風險，對研究者乃至公眾健康都會造成威脅。國家主管部門要求開展流感病毒相關科學實驗必須在生物安全三級實驗室進行[2]，不準在開放性實驗室用于實驗教學。研究[3]發現雞新城疫病毒也具有典型的HA和HI現象，而且該病毒感染具有種屬特異性，一般不感染人類。采用雞新城疫疫苗替代流感病毒進行HA及HI試驗進行實驗教學，可有效降低感染風險，并解決后者不能直接用于開放性實驗室實驗教學的難題。該研究采用國家批準的低毒力雞新城疫疫苗(La Sota株)替代流感H9N2株疫苗株，并用0.25%甲醛溶液再處理已減毒的雞新城疫La Sota株活疫苗；經安全檢驗及對比試驗，已獲得可靠可信的結果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1疫苗株 雞新城疫低毒力活疫苗(La Sota株)購自齊魯動物保健品有限公司，批準文號：獸藥生字150252007；流感病毒(H9N2)疫苗株，揚州大學獸醫學院惠贈，作為試驗對照病毒株。

1.1.2雞胚 SPF雞胚購自安徽天長威格爾科技有限公司。

1.1.3試劑 甲醛溶液購自上海國藥集團化學試劑公司，批號：090918，含量38%～40%。

1.1.4設備 BHC-1300HA2型Ⅱ級生物安全柜(蘇州安泰空氣技術有限公司)；96孔V形微量血凝板(康寧公司)。

1.2 方法

1.2.1安全檢驗[4]用雞胚檢驗，將雞新城疫低毒力活疫苗10倍稀釋后接種于40只雞胚，每胚接種0.1 ml，接種后密封針孔，置37 ℃孵育，雞胚接種后，每日檢卵照室觀察2次。接種后24～72 h內雞胚死亡率≤20%，判為合格；若2次檢驗結果均在接種后48 h內全部死亡，則判為不安全，疫苗不可用。收獲雞胚尿囊液病毒。流感H9N2疫苗株的檢驗方法同上。

1.2.2滅活處理穩定性試驗 向上述收獲的雞胚尿囊液中加入甲醛溶液，使甲醛的終濃度分別為0.1%和0.25%。置4 ℃滅活處理24 h。并分別在滅活處理后的第1、12、24、36、48、60、72 h取樣，測定各自標本的血凝效價。期間振搖3～4次，分別收獲雞新城疫苗雞胚尿囊液和流感疫苗雞胚尿囊液。無菌分裝，4 ℃保存備用。

1.2.3免疫血清制備 選用5月齡來航公雞、體質量2～2.5 kg/只、健壯無感染疾患10只，安徽醫科大學動物中心提供[SYXK(皖)2017-006]，分籠飼養。采用制備的0.25%甲醛滅活處理新城疫疫苗免疫5只，流感疫苗免疫5只，每周肌注免疫1次，每次1 ml，共免疫5周后，心臟抽血，離心、分離血清，收集滅活處理的新城疫疫苗免疫血清和流感疫苗免疫血清，分裝于無菌瓶內4 ℃保存, 在實驗教學替代流感疫苗HI試驗使用。分別作微量HA及HI試驗，檢測滅活處理的雞胚尿囊液中新城疫苗與流感疫苗效價[5]。

1.2.4微量HA試驗 于96孔V形微量血凝板每孔中滴加磷酸鹽緩沖液(PBS)50 μl，共滴2排，標記為A，0.25%甲醛滅活處理雞新城疫疫苗1 ∶5稀釋后加于第1列孔，每孔50 μl，然后由左至右順序倍比稀釋至第11孔，再從第11孔各吸取50 μl棄之，最后一列作為PBS稀釋液對照。于每孔加入0.5%雞紅細胞懸液50 μl，放室溫靜置40 min，判定結果。以出現雞紅細胞完全凝集的滅活處理新城疫疫苗最大稀釋度為該苗的血凝效價。作為陽性對照的流感疫苗共滴2排，標記為B，第1列孔為原液，方法同上。

1.2.5微量HI試驗 首先配置4個血凝單位的雞新城疫疫苗懸液。據上述HA實驗測得病毒的血凝效價為1 ∶640，根據此效價，計算并將上述雞新城疫疫苗懸液作160倍稀釋后，即為該疫苗懸液稀釋液的4個血凝單位(4 HAU)，然后進行血凝抑制試驗。即分別在兩排血凝板孔中第1～11孔各加入25 μl PBS，第12孔加入50 μl PBS。如在第1列孔加入25 μl雞新城疫疫苗免疫血清，充分混勻后，移出25 μl加至第2孔，依次類推，倍比稀釋至第10孔，第10孔棄去25 μl；第11孔設為病毒對照，第12孔為紅細胞對照，共滴2排，標記為A。在第1～11孔各加入25 μl 4 HAU，混合均勻，依次向各孔加入0.5%雞紅細胞懸液25 μl，室溫靜置40 min 后觀察結果。在病毒對照孔的雞紅細胞出現完全凝集的情況下，判讀該血清的效價，即血清的最大稀釋倍數孔出現雞紅細胞凝集完全被抑制(呈紅色原點狀)的現象即為該血清的血凝抑制效價。陽性對照的流感疫苗雞胚尿囊液共滴4排，標記為B，1 ∶10滴加于第1列孔，方法同上。

1.2.6實驗教學與抽檢符合率 滅活處理的雞新城疫疫苗替代流感病毒HA及HI試驗作為本碩臨床醫學及其他專業本科微生物實驗教學用，測定HA及HI效價，并分別計算抽檢符合率和教學符合率。

1.3 安全性評估計算雞新城疫疫苗與流感疫苗接種雞胚后兩組的死亡率，并統計差異是否具有統計學意義。

2 結果

2.1 安全檢驗結果比較接種后第24～72 h內，雞新城疫苗雞胚死亡率5%，判為合格，流感疫苗雞胚死亡率7.5%，判為合格，兩種疫苗死亡率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 雞新城疫疫苗與流感疫苗(H9N2)接種雞胚

2.2 滅活處理穩定性實驗結果比較分別配置甲醛終濃度為0.1%和0.25%雞新城疫疫苗液，4 ℃滅活處理24 h。另取未滅活雞新城疫疫苗液和流感疫苗液，分別在第1、12、24、36、48、60、72 h共計7個時間點取樣，同時進行HA試驗，比較4種樣品血凝效價變化。0.25%甲醛滅活處理雞新城疫疫苗第72 h之內其血凝效價不變，始終保持1 ∶640；0.1%甲醛滅活處理其血凝效價在第60 h之內不變，第72 h下降為1 ∶320。而未處理的雞新城疫疫苗從第36 h開始下降，第72 h下降為1 ∶160。流感疫苗從第24 h開始下降，第72 h下降為1 ∶160。見圖1。

2.3 滅活雞新城疫苗與流感疫苗微量HA及HI試驗結果比較測定滅活雞新城疫苗HA試驗的血凝效價為1 ∶640，免疫血清HI滴度為1 ∶512。對照流感疫苗HA試驗的血凝效價為1 ∶640，免疫血清HI滴度為1 ∶512。見圖2、3。

圖1 四種不同樣品HA效價隨時間變化趨勢圖

2.4 抽檢符合率與實驗教學符合率比較不同年份的滅活雞新城疫疫苗HA和HI試驗抽檢符合率均為100%。實驗教學符合率>90%。滅活雞新城疫疫苗及其免疫血清用于本碩臨床醫學專業、其他本科專業以及抽檢的樣品三組之間的符合率差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

圖2 兩種疫苗的HA試驗結果A：行為滅活雞新城疫疫苗；B：行為流感疫苗；1～11：HA試驗組；12：紅細胞對照組

圖3 兩種疫苗的HI試驗結果A：行為雞新城疫疫苗；B：行為流感疫苗；1～10：HI試驗組；11：病毒對照組；12：紅細胞對照組表2 滅活雞新城疫疫苗HA及HI試驗抽檢符合率與實驗教學符合率比較

年份本碩專業教學實驗數(份)符合數(份)符合率(%)本科專業教學實驗數(份)符合數(份)符合率(%)復檢數抽檢數(份)符合數(份)符合率(%)χ2值P值201418016290.088081192.218181001.9860.358201521019391.996086690.218181001.8210.358201621018990.01 0249229018181001.4830.511201733030793.0 1 1201 0309218181001.1870.495

3 討論

流感病毒主要通過其表面的血凝素蛋白感染宿主易感細胞；而血凝素蛋白可以與脊椎動物紅細胞表面的唾液酸受體結合，從而使紅細胞之間發生凝集。當足量的特異性抗體與病毒預先處理后，病毒表面的血凝素蛋白被特異的抗體封閉，便失去HA活性，此種現象稱之為HI現象[5]。近年來，國內外曾經發生過人體“非典”病毒實驗室內感染的事件，使得實驗室生物安全管理與控制顯得尤為突出[6]。我們經過多年來不斷探索改良實驗技術與方法，通過向雞新城疫低毒力活疫苗(La Sota株)中添加0.25%甲醛從而達到滅活低毒力活疫苗，使其失去感染能力但是不損害病毒血凝素分子的血凝活性。甲醛滅活可使活疫苗蛋白的高級結構受到破壞，失去生物活性，病毒失去感染性和致病性。但滅活過程不影響疫苗蛋白的一級結構，血凝素蛋白的序列無變化[7-8]。本實驗結果表明，0.25%甲醛溶液在4 ℃滅活處理雞新城疫低毒力活疫苗24 h后，血凝效價穩定，安全檢驗雞胚死亡率≤5%，試劑合格，達到實驗教學替代流感疫苗HA及HI試驗用標準要求。而且滅活處理雞新城疫活疫苗HA及HI試驗直觀、安全、可靠和穩定。從2014～2017年本碩臨床醫學及其他專業本科專業和微生物實驗教學中，抽檢符合率達100%，教學符合率在90%以上，效果顯著，從未發生過實驗室感染事件。這種確保教學質量和實驗室生物安全的實驗室試驗材料的“替代”，是微生物實驗教學不可缺少的一部分，值得進一步推廣應用。