組蛋白去乙酰化酶家族成員在缺血性腦卒中應用研究

劉 戀 趙 博 夏中元

腦卒中因其高患病率、高致殘率和高致死率一直以來是研究的一大熱點。同時，由再灌注造成的繼發性損傷將會導致更嚴重的后果，如血-腦脊液屏障破壞，炎癥和缺血后神經元損傷等[1]。組蛋白去乙酰化酶(HDACs)靶向作用于組蛋白，調節染色體活力，調控細胞的基因表達，可調節與神經可塑性、細胞存活、神經炎癥以及氧化應激等相關的多種信號通路[2]。因此，HDACs很可能在腦卒中的病理生理過程中發揮著重要作用。

一、HDACs家族概述

HDACs作為一類酶家族，是多蛋白復合物的催化亞基，通過調控組蛋白、非組蛋白的乙酰化水平，對基因轉錄的穩態維持起著重要作用[3]。基于結構、序列同源性和結構域布局等的不同，將HDACs家族成員分為了4類：Ⅰ類(HDAC 1～3和8)，Ⅱ類(HDAC 4～7,9和10)和Ⅳ類(HDAC 11)這3類HDACs是鋅依賴性的，并且具有相似的序列，故被稱為經典的的HDACs家族；而Ⅲ類(sirtuin1～7)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴性的，未被列入經典的HDACs家族[4,5]。HDACs家族各成員的表達部位、分布情況以及對靶基因的調控等不盡相同，因此發揮的功能也有所差別：Ⅰ類成員是一種核蛋白，在機體各組織臟器中廣泛表達，可在細胞核內與共同轉錄抑制子結合，從而使染色體組蛋白、非組蛋白去乙酰化而抑制轉錄；Ⅱ類成員的表達具有階段性的特異性，特定的細胞信號可將其激活，活化的Ⅱ類成員穿梭于胞核和胞質之間，在細胞核內通過類似于Ⅰ類成員的方式結合共同轉錄抑制子，從而抑制轉錄，另外，其可在某些刺激因子作用下,結合大量的信號轉導蛋白以及功能蛋白，促進它們在胞核與胞質之間穿梭，從而對下游靶基因的轉錄進行調控，參與了一系列病理生理過程[4, 6]。

二、HDACs家族成員與腦卒中

調節組蛋白乙酰化是染色質調制和基因調節的一個重要組成部分，在細胞增殖和分化等多種生物學過程中發揮重要作用[3]。最近的研究詳細闡明了組蛋白乙酰化在中樞神經系統中發揮的重要作用，如神經元分化、記憶形成、藥物成癮等[7]。HDACs將組蛋白的乙酰基移除，導致了染色質凝聚，降低了DNA與轉錄因子的親和力[4]。多種HDACs抑制劑，如VPA、TSA、SAHA等均被證明在腦卒中中發揮了重要的神經保護作用[8]。然而，近期亦有一些研究報道了，HDACs家族中也有部分成員其本身在很多病理性損傷(包括腦缺血)中也表現出保護性作用[9～11]。現對該家族成員在腦卒中領域中的作用進行逐一闡述如下：

1.HDAC1與腦卒中：在HDACs家族中，HDAC1是第一個被鑒定出來的具有組蛋白定向去乙酰酶活性的哺乳動物蛋白，其在調節細胞周期方面發揮著重要作用，且在細胞周期基因的轉錄抑制過程中必不可少[12]。HDAC1和特定基因啟動子區域的聯系與它們的轉錄抑制相關聯。細胞周期重入、DNA損傷和P25積累成為各種神經退行性疾病的重要病理組成部分，這一途徑可能構成負責多種疾病如腦卒中/缺血等的神經元死亡的共同機制[13]。在動物的在體模型研究中發現，HDAC1活性的反常參與了P25介導的DNA雙鏈斷裂形成，細胞周期蛋白表達以及神經元死亡；增加HDAC1的活性可以保護神經元對抗缺血誘導的DNA損傷以及神經興奮性毒性[10]。

2.HDAC2與腦卒中:HDAC2被報道可以負性調節細胞存活以及神經元可塑性[14]。將選擇性表達HDAC2的腺病毒在小鼠腦卒中后即刻注入梗死周邊的皮質，發現在腦卒中后第5天HDAC2的水平和活性增加，在卒中后的第8天腦卒中誘導的功能缺損顯著加重，說明在梗死周邊皮質的HDAC2在腦卒中后的二次功能缺損中也發揮著重要作用[2]。腦缺血誘導的HDAC2在卒中后5～7天上調，在這個時間窗內，抑制缺血周邊皮質的HDAC2可以通過表觀遺傳學增強細胞存活，促進神經元可塑性的恢復以及減少炎性反應的發生，進而有助于改善腦卒中后的運動功能[2]。

使用藥理學抑制劑選擇性抑制HDAC1和HDAC2，以及使用siRNA特異性敲除HDAC1和HDAC2均抑制了炎性因子(IL-6和TNF-α)的表達，但是單獨敲除HDAC1時，HDAC2代償性地表達上調，炎性因子的表達未被抑制，表明這兩個HDACs在調節神經炎性反應時存在冗余[15]。進一步研究其具體機制，有利于更好地闡述HDAC2涉及的神經保護作用。

3.HDAC3與腦卒中：HDAC3是來自芽殖酵母的Rpd3的同源物，已經在多種神經病理學條件下被證明與神經毒性相關[5, 8]。破壞HDAC3的螯合比例以及HDAC3的釋放，可引起神經毒性的活化。HDAC3活性被抑制，可使小腦顆粒神經元對抗低鉀損害，而HDAC3的過表達可促進神經元的死亡[16]。

腦缺血可引起皮質神經元以及缺血核心周邊區域(缺血半暗帶區)的HDAC3表達上調，抑制HDAC3的表達可增加中樞神經系統對缺血性損傷的耐受[17]。HDAC3的特異性抑制可通過啟動與神經保護相關的基因表達程序來預處理腦組織對抗缺血性損傷，此外，鈣調素參與了HDAC3的裂解，阻斷HDAC3的核分布[8]。故HDAC3抑制在缺血預處理引起的神經保護作用中起著重要作用，為腦卒中的治療提供了一種新的藥理學方法。

4.HDAC4、HDAC5與腦卒中：HDAC4在小腦顆粒神經元中高度表達，并可以調節此處神經元的凋亡[18]。HDAC5主要定位在皮質神經元，其mRNA在此處高度表達。HDAC4和HDAC5屬于Ⅱa類HDACs家族，可與轉錄因子相互作用，并與核輸出信號相關[4]。已有報道表明HDAC4通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)和細胞周期進程來保護神經元免于死亡，并通過增強缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的穩定性調節小鼠視網膜神經元的存活[19]。HDAC5被認為是對慢性應激和可卡因成癮的適應性反應的關鍵調節因子[20]。由此可見，HDAC4和HDAC5可能在外周和中樞神經系統中發揮重要作用。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶產生的活性氧(ROS)可影響缺血性腦卒中的基因表達和細胞功能[21]。最新研究表明HDAC4和HDAC5在模擬腦卒中的體內外模型的研究中均顯著降低，其過表達可在缺糖缺氧條件下保護凋亡細胞免于死亡。腦缺血再灌注損傷顯著增強了NADPH氧化酶的活性，HDAC4和HDAC5表達的調節與NADPH氧化酶活性相關，表明NADPH氧化酶對腦缺血再灌注大鼠中HDAC4和HDAC5的調節有一定的作用[11]。 最新研究表明抑制NADPH氧化酶活性在腦缺血再灌注損傷中的神經保護作用可能至少部分地通過調節HDAC4/HDAC5介導的組蛋白乙酰化和基因轉錄來實現[11]。高遷移率組盒1(HMGB1)參與了缺血性腦卒中的發病機制，其下調可減少神經炎癥，使腦梗死體積減小[22]。過表達HDAC4和HDAC5，可以降低HMGB1釋放和表達[11]。HMGB1被報道可誘導PC12(一種模擬神經元的細胞系)細胞凋亡[23]。因此，在缺血性腦卒中發作時可以通過調控HDAC4和HDAC5的表達進而調控HMGB1從而在腦卒中的發生、發展中發揮保護作用，這可能對缺血性腦卒中的防治提供了重要的治療策略。

5.HDAC6與腦卒中：HDAC6屬于HDACs家族Ⅱb類組的成員，主要分布于細胞質內，調控了多種胞質蛋白的乙酰化水平，并參與了一系列疾病的病理生理過程[4]。選擇性抑制HDAC6可保護神經細胞生長，促進軸突再生，增強損傷后神經修復以及中樞神經系統的學習記憶能力[24]。HDAC6通過去乙酰化-微管蛋白以調節微管穩定性，對錯誤折疊的蛋白的應激反應至關重要，抑制HDAC6可以通過增加微管蛋白乙酰化來增強關鍵性神經營養因子腦源性神經營養因子(BDNF)的轉運和釋放[25]。在缺血引起的氧化應激模型中，HDAC6可以使神經元胞體或軸突中的某些蛋白去乙酰化，從而抑制細胞的再生或促進細胞的死亡[26]。因此HDAC6可能作用于氧化應激的下游分子靶點，從而介導了其下游的一系列的病理生理過程。

在中樞神經系統疾病的治療中，HDAC6是神經保護和再生的一個潛在作用靶標[26]。腦缺血可以增加HDAC6的表達，并通過解聚微管和減少動力蛋白水平來破壞基于微管的運輸，從而破壞神經元胞體和軸突/樹突之間的線粒體轉運，進一步引起線粒體功能障礙和隨后的細胞死亡[5]。抑制HDAC6可以改善腦缺血后線粒體轉運缺陷并保留成纖維細胞生長因子-21 (FGF-21,一種代謝調節因子，在神經元中表達)水平，繼而通過靶向Akt信號通路對谷氨酸誘導的興奮性毒性產生神經保護作用，同時極大地減少了腦梗死體積、神經功能缺損和神經元細胞的死亡[27]。在小鼠腦卒中模型研究中發現使用HDAC6的特異性抑制劑可增加入侵腦的調節性T細胞(Tregs)的數量，提高其免疫抑制能力和促炎性因子白細胞介素(IL)-10表達，減少了腦皮質缺血后腦梗死的體積和行為缺陷[28]。因此，藥理學水平靶向HDAC6介導的多種信號通路或通過其對Tregs的功能進行調節從而介導內源性免疫調節機制，可能有助于設計出一種新方法，以預防和治療腦卒中。

6.HDAC7與腦卒中:內源性HDAC7主要定位于細胞質，低水平存在于細胞核中[18]。HDAC7在培養的小腦顆粒神經元(CGNs)中的強制表達阻止低鉀誘發的細胞凋亡，shRNA介導的HDAC7表達抑制可以誘導其他健康神經元的凋亡。HDAC7介導的神經保護不需要其催化結構域，不能被HDACs的化學抑制劑抑制[9]。HDAC7被證明是一種神經保護蛋白，通過不依賴于其脫乙酰化酶活性發揮作用，并且可在轉錄水平介導c-jun(一種促進神經元死亡的重要轉錄因子)表達的抑制[9, 29]。雖然目前HDAC11在腦卒中領域的研究較少，但是為以后的進一步研究奠定了一定的基礎。雖然上述研究均在神經退行性疾病模型中進行，但相關機制給腦卒中領域的研究提供了方向。

7.HDAC9與腦卒中:HDAC9，Ⅱa類HDACs家族中的另一個成員，可以調節各種疾病的病理生理過程，在大鼠腦缺血再灌注損傷后的缺血半球表達上調[30]。通常，HDAC9在腦和骨骼肌中高表達，與生存不良有關，但對于其在腦中的作用知之甚少[31]。全基因組研究鑒定出了一個與大血管的缺血性腦卒中相關的HDAC9的變體，該遺傳變異體增加了頸動脈粥樣硬化的風險，然而其在缺血性腦卒中的分子途徑尚未明確[32]。因此，其在腦卒中的作用值得進一步研究。

研究發現HDAC9在腦卒中的體外模型中促進了缺糖、缺氧誘導的炎性反應、內皮細胞通透性和凋亡，同時也減少了自噬[30]。越來越多的研究表明內皮細胞自噬的減少可能是引起血管生物學中內皮功能紊亂的一種中樞機制[33]。另有研究顯示缺糖缺氧誘導的內皮細胞炎性反應和滲透功能紊亂可以被雷帕霉素(自噬誘導劑)緩解，雷帕霉素在暴露于缺糖、缺氧的血管內皮細胞中誘導了保護性自噬的產生[34]。HDAC9通過增加炎性反應、細胞凋亡和內皮細胞通透性紊亂，減少緊密連接蛋白的表達以及抑制自噬等促進了缺糖、缺氧誘導的腦微血管內皮細胞功能障礙[30]。因此，HDAC9是缺血性腦卒中治療的另一個潛在的靶點。

8.HDAC11與腦卒中：HDAC11是HDACs家族唯一的Ⅳ類成員，其與Ⅰ類和Ⅱ類HDACs具有一些相似的特征，主要在腎臟、心臟、骨骼肌、睪丸和腦的細胞核中表達[25]。HDAC11在中樞神經系統組蛋白去乙酰化過程中發揮作用，并與出生后發育期間少突膠質細胞和神經元的發育相關。HDAC11在海馬中的表達異常與學習和記憶障礙密切相關。HDAC11在普肯野(Purkinje)細胞層中選擇性高表達可能表明其在自主運動和共濟失調綜合征中發揮重要作用[18]。有報道顯示，HDAC11與HDAC6有關聯，HDAC6可能通過HDAC11調控基因表達[5]。與HDAC6相似，HDAC11在腦缺血再灌注3h后顯著上調，隨后水平開始下降，并且24h顯著下降，其早期表達增強可能與腦卒中誘發的炎癥的發生和加重有關[5]。HDAC6還可通過使非組蛋白(如α-微管蛋白，皮質激素和熱休克蛋90)去乙酰化，來調節包括基于微管的轉運、細胞運動、內吞作用、細胞遷移、自噬等的各項生命過程[5]。因此，HDAC11可能也參與了上述過程的調控，這針對進一步研究提供了新的方向。

三、展 望

綜上所述，關于HDACs家族成員的各個亞型與缺血性腦卒中的相關性的研究仍不夠全面。未來對HDACs家族的研究重在闡明HDACs亞型在缺血性腦卒中的個體化作用，進而設計出特異性更高的HDACs抑制劑，從而更好的用于腦卒中的預防與治療。因此，探討組蛋白去乙酰化酶在缺血性腦卒中中的具體機制，明確參與缺血性腦卒中的具體亞型，都將有助于研制出特異性更強的抑制劑，從而更好地應用于缺血性腦卒中的治療。