紅曲黃色素脂質體制備工藝及穩定性考察

吳坤 陳磊 經來 王文正 黃蘭蘭 葉貝 李妍

摘 要：以紅曲黃色素為實驗材料，采用薄膜分散法制備紅曲黃色素脂質體。在單因素實驗下，利用4因素3水平的Box-Behnken8.0.6對紅曲黃色素脂質體的包封率進行優化設計分析，結果表明：紅曲黃色素脂質體的最佳工藝條件為，藥脂比為1∶20.4，超聲提取時間36.8min，膜材比為4.32∶1，水化溫度41.2℃，在此條件下包封率為61.4%，與響應面預測值（62.57%）的相對誤差為1.8%，實驗可靠;抗氧化性實驗表明紅曲黃色素脂質體能夠在一定程度上有效的清除DPPH的自由基，穩定性較好。

關鍵詞：紅曲黃色素;薄膜分散法;響應面;抗氧化性

中圖分類號 TS202文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）20-0118-06

Abstract：Use red yeast pigment，soy lecithin，cholesterol as the main experimental raw material，Monascus pigment liposome prepared by thin film dispersion method，Under the operation of single factor experiment，the encapsulation efficiency of Monascus pigment liposome was optimized by using the Box-Behnken center experiment of 4 factors and 3 levels. The experiment showed that the optimal process conditions of Monascus pigment liposome The ultrasonic extraction time was 36.8 min，the hydration temperature was 41.2°C，the membrane ratio was 4.32∶1，the ratio of drugw to lipid was 1∶20.4，the predicted surface response was 0.6257，and the actual verification value was 0.614. The relative error was 1.8%.The results of experiment is reliable.Antioxidant experiments showed that monascus yellow liposome can effectively remove DPPH free radicals to some extent.

Key words：Red Yeast Yellow Pigment;Water Soluble Pigment;Response Surface;Stability

引言

紅曲色素是聚酮類化合物的總稱，是紅曲菌在代謝過程中產生的次級代謝產物[1]。紅曲色素作為可食用色素，常被用作食品染色劑和膳食材料，主要用作于食品、中藥、調味品、釀酒行業中[2]。紅曲黃色素是紅曲黃霉通過次級代謝產生的結構與洛伐他汀相似的聚酮類化合物，而洛伐他汀在全球范圍內被公認為具有降低膽固醇的作用，因此，紅曲黃色素在一定程度上能夠起到降低人體血脂含量的作用[3]。

脂質體可以同時包埋具有疏水性和親水性的物質，它具有類雙分子層的閉合囊狀結構，能夠將藥物包裹在內部[4]，對靶組織有高度的選擇性，具有一定的藥物靶向性，能夠起到降低毒副作用，提高療效[5]，且有一定的緩釋作用，常被用作是藥物的遞送系統[6]。

本實驗擬采用薄膜分散法制備紅曲黃色素脂質體，確定紅曲黃色素脂質體的最優制備方案，以紅曲黃色素脂質體包封率為綜合考察指標，以期得到一種簡單有效的制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 紅曲黃色素（AR，上海源葉生物科技有限公司）、大豆卵磷脂（上海虹泉生物科技有限公司，純度[≥]97%）、膽固醇、甲醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉三氯甲烷、石油醚、無水乙醇（均為分析純）、一級純化水（實驗室自制）。

1.2 儀器與設備 H4-20KR高速冷凍離心機（安徽中華中佳科學儀器有限公司）、電子天平AB323（上海海康電子儀器廠）、旋轉蒸發儀RE-2000B（鞏義市予華儀器有限責任公司）、TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、J數顯恒溫水浴鍋HH-1（浦怡電子科技有限公司）、K-500DB型數控超聲清洗器（合肥金尼克機械制造有限公司）、超純水機G1410005（重慶摩爾水處理設備有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程 按比例稱取一定量的大豆卵磷脂和膽固醇→加入相應量的紅曲黃色素→超聲→旋蒸→水化→孵化。

1.3.2 標準曲線的建立 由文獻得知紅曲黃色素在波長為500nm附近有吸收峰[7]，準確稱取紅曲黃色素0.1mg溶于無水乙醇中，并超聲處理30min，進行波長掃描，在波長為460nm處有最大吸收峰。

精確稱取0.010g紅曲黃色素標準品，加入乙醇充分溶解后，用無水乙醇進行定容至100mL;從中取得10mL溶液再加入無水乙醇使其定容到100mL搖勻;既得0.01mg/mL的紅曲黃色素標準溶液;依照上述操作再分別配制濃度為0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的紅曲黃色素溶液，然后再460nm波長處測定吸光度（無水乙醇為空白對照），繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.438x-0.022，R2=0.9988，見圖1。

1.3.3 包封率的計算 將制備好的脂質體懸浮液移取1mL，用甲醇定容到25mL，靜置3h測得吸光度M總，懸浮液在轉速為10000rpm/min的速度下離心30min，按照項1.3.2測得上清液的吸光度，得游離的紅曲黃色素[M1]，包封率公式見公式1。

包封率=[M總-M1M總]×100? （1）

式中：[M1]為游離的紅曲黃色素濃度，[M總]為紅曲黃色素的總濃度。

1.3.4 單因素實驗 （1）膜材比：精確稱取1.0000g大豆卵磷脂，按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1的比例分別稱取6份膽固醇，按照大豆卵磷脂∶紅曲黃=20∶1的比例稱取0.05g紅曲黃，加入20mL氯仿，超聲30min，懸蒸，水化，孵化溫度45℃，分別經離心后按項1.3.2測吸光度，根據項1.3.3計算包封率，平行3次。（2）藥脂比：精準稱取1.0000g大豆卵磷脂6份，稱取0.25g膽固醇6份，按照紅曲黃色素∶大豆卵磷脂的比例分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30稱取紅曲黃，加入20mL氯仿，超聲30min，懸蒸，水化，輔化溫度45℃，分別經離心后按項1.3.2測吸光度，根據項1.3.3計算包封率，每組實驗重復3次。（3）超聲時間：精確稱取1.0000g大豆卵磷脂6份，按照大豆卵磷脂∶膽固醇∶紅曲黃=20∶5∶1的比例稱取0.25g膽固醇和0.05g紅曲黃，加入20mL氯仿，分別置于時間為25min、30min、35min、40min、45min條件下進行超聲處理，懸蒸，水化，輔化溫度45℃，分別經離心后測吸光度，根據項1.3.3計算包封率，每組實驗重復3次。（4）水化溫度：精確稱取1.0000g大豆卵磷脂6份，按照大豆卵磷脂∶膽固醇∶紅曲黃=20∶5∶1的比例稱取0.25g膽固醇和0.05g紅曲黃，加入20mL氯仿，超聲處理40min，懸蒸，分別在溫度為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的條件下水化，分別經離心和破乳后測吸光度，根據項1.3.3計算包封率，每組實驗重復3次。

1.3.5 響應面法優化提取工藝 根據單因素實驗結果數據分析可以得出藥脂比、膜材比、超聲時間、水化溫度對脂質體的包封率影響較為明顯，采取Box-Benhnken設計[8]應面實驗以藥脂比、膜材比、超聲時間、水化溫度作為自變量，以紅曲黃色素的包封率為實驗結果，表1為實驗因素的水平編碼表。

1.3.6 驗證試驗 通過響應面優化設計后的實驗結果進行數據分析，可以得到最佳的脂質體的制備條件，并重復實驗3次，取得3次試驗的平均值與模型預測的理論值相比較。

1.3.7 抗氧化性試驗 有文獻表明包封率較低的脂質體能夠清除DPPH自由基的能力比包封率較高的脂質體清除DPPH自由基的能力較低[9]的實際情況，通過測定DPPH的清除力來測定紅曲黃色素脂質體的抗氧化活性。精確吸取1mL樣品（紅曲黃色素脂質體、空白脂質體），加入2mLDPPH乙醇溶液混合均勻，在光線陰暗處使其反應40min，于波長520nm處測得上清液吸光度A1，用PBS緩沖液代替空白樣測得吸光度A2，用乙醇溶液替代DPPH測得吸光度A3，計算公式如下：

DPPH自由基清除率（%）=[1-A1-A3A2×10]0? （2）

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 藥脂比的影響 如圖2所示，當藥脂比（1∶X）在不斷減小時，脂質體的包封率呈現1個上升的趨勢，并在藥脂比為1∶20時，包封率達到最高，可能的原因是由于一開始藥物的投入量比較高，使得藥物超出了脂質體的最大藥物負荷量，不能有效地包裹住所有的藥物，從而使得游離中的藥物的濃度過大，導致脂質體的包封率較低;也有可能是膽固醇和大豆卵磷脂的濃度過高，使得脂質體發生聚集，降低了脂質體的穩定性，使得藥物發生滲漏。后來隨著藥脂比的不斷減小，脂質體的包封率出現1個明顯下降的趨勢，可能的原因是隨著藥脂比的不斷減小，脂質體包含藥物的有效含量過低[10]，測得的吸光度和離心后上清液的吸光度相差不大，導致包封率較小。

2.1.2 膜材比的影響 如圖3所示，當膜材比（1∶X）逐漸增大時，包封率呈現1個上升的趨勢，前段包封率低可能是由于大豆卵磷脂的含量過多，在水化的過程中比較困難，卵磷脂容易凝聚[11]，后來隨著膜材比的逐漸增大，使得大豆卵磷脂的相對含量降低，包封率上升，并且在膜材比為4∶1時，達到了最大值，后來隨著膽固醇的量增大到一定程度時，脂質體膜的親水性較強，脂質體相互聚集使得膜易被破壞，包裹住的藥物比較容易發生滲漏，導致包封率較低。

2.1.3 超聲時間的影響 如圖4所示，超聲時間在25-40min的過程中，脂質體的包封率呈現1個上升的狀態，且在超聲時間為40min時達到最大值，可能是由于超聲的有效時間過短，使脂質體不能均勻分散開來，脂質體相互聚集導致膜易破碎，藥物流失嚴重，隨著超聲時間的逐漸加長，包封率呈現1個下降的趨勢，應該是由于超聲本身所具有的熱效應導致的溫度上升使得脂質體膜易被破壞[12]，還有可能就是超聲時間過長，使得脂質氧化，藥物滲漏，造成包封率下降。

2.1.4 水化溫度的影響圖 如圖5所示，當溫度由25℃逐漸上升到40℃時，包封率呈現1個明顯的上升狀態，且在40℃左右時，脂質體的穩定性較好，包封率較高;溫度>40℃時，可能是由于溫度過高加速了磷脂的氧化，藥物的穩定性較差，使得脂質體膜易破碎，導致藥物的流出。包封率下降[13]。

2.2 響應面法設計及結果

2.2.1 響應面優化實驗結果 根據單因素實驗，利用Box-Behnken實驗設計原理，實驗結果分析如表2所示。

在單因素實驗的基礎上，利用Box-Behnken實驗設計原理，選取藥脂比，膜材比，超聲時間和水化溫度為自變量，紅曲黃色素的包封率為響應值。利用軟件Design Expert 8.0.6，對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，得到紅曲黃色素包封率和實驗變量A、B、C、D二次回歸方程：

Y=62.0+0.39A+1.20B-1.57C+3.79D-9.43A2-7.07B2-9.35C2-7.96D2

由表3顯示，A、B、C、D 4個因素對該模型的影響作用大小為D>C>B>A，該回歸模型較為顯著（P=0.0003<0.01），模型失擬項P=0.3390>0.05，且失擬項不顯著，說明該模型的建立和試驗數據的模擬程度一般。并且在通過Box-behnken軟件分析得到紅曲黃色素脂質體制備的最佳工藝參數為超聲提取時間36.8min，超聲提取溫度49.6℃，膜材比為4.32∶1，藥脂比為1∶20.4。在最優提取條件下，紅曲黃色素脂質體的包封率為62.572%。

3.2.2 等高線圖和響應曲面圖分析 如圖6所示，當超聲時間為36.8min，水化溫度為49.6℃時，通過分析最佳工藝條件可以得出，當藥脂比在1∶15～1∶20.4的區域范圍內，膜材比在3∶1～4.32∶1的區域內脂質體的包封率隨著膜材比和藥脂比的變化而不斷上升，但上升趨勢較為緩慢，當藥脂比為20.4∶1時，膜材比為4.32∶1時，脂質體的包封率達到最大值。

如圖7所示，當超聲時間為36.8min，膜材比為4.32∶1時，通過分析最佳工藝條件可以得出，當藥脂比在1∶15～1∶20.4的區域范圍內，水化溫度在35℃～49.6℃的區域范圍內，脂質體的包封率隨著水化溫度和藥脂比的變化而不斷上升，但上升趨勢較為緩慢，當藥脂比為20.4∶1時，水化溫度為49.6℃時，脂質體的包封率達到最大值。

如圖8所示，當超聲時間為36.8min，膜材比為4.32∶1時，通過分析最佳工藝條件可以得出，當藥脂比在1∶15～1∶20.4的區域范圍內，水化溫度在35℃～49.6℃的區域范圍內，脂質體的包封率隨著水化溫度和藥脂比的變化而不斷上升，但上升趨勢較為緩慢，當藥脂比為20.4∶1時，水化溫度為49.6時，脂質體的包封率達到最大值。

1.3.3 驗證性實驗 由表4可知，為驗證模型可靠性，再用上述優化的最佳提取條件和考慮實際情況后，采用超聲時間36.8min，水化溫度41℃，藥脂比為1∶20.4，膜材比為4.32∶1進行實驗，實際驗證包封率的平均值為61.4%，相對誤差為1.8%。表明該模型能夠真實反映出各因素對紅曲黃色素脂質體包封率的影響，因此該回歸模型具有一定的真實的可靠性。

2.3 抗氧化性試驗 由圖9可知，在反應時間為40min的情況下，紅曲黃色素脂質體能夠有效地抑制DPPH自由基的產生，隨著加入的溶液體積越大，清除率就越大，同時在反應過程中應注意此反應全過程應在光線陰暗處進行。

3 結論

本實驗采用薄膜分散法對紅曲黃色素脂質體進行制備，以膜材比、藥脂比、超聲時間、水化溫度為單因素進行實驗，其中藥脂比大小對脂質體的包封率影響最大，在此基礎上進行了4因素3水平的Box-Behnken實驗設計，得到紅曲黃色素的最佳提取工藝為藥脂比為1∶20.4，水化溫度41.2℃，超聲時間36.8min，膜材比為4.32∶1。在此提取條件下，預測紅曲黃色素脂質體的包封率為62.572%，通過實際操作，選擇水化溫度為41℃，超聲時間為36min，膜材比為4.3∶1，藥脂比為1∶20進行實驗，重復3次實驗得到包封率為61.4%，相對誤差1.8%，結果表明，實驗模擬的擬合程度一般，說明預測的優化工藝合理，且根據DPPH的抗氧化試驗結果可知，紅曲黃色素脂質體的穩定較好。

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（責編：楊 林）