Exendin-4對高脂飲食載脂蛋白E基因敲除小鼠脂代謝及炎癥因子的影響

涂 強，吳瑞霞，楊 勇，謝 華， 謝華強，陳平英， 曹 政，2

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴重危害國民健康的重大疾病。脂質代謝紊亂和炎癥反應是動脈粥樣硬化發生發展的重要因素，調脂和抗炎治療是防治動脈粥樣硬化的有效措施[1]。Exendin-4是胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受體激動劑，為首個在美國獲準的腸促胰島素擬似物。近年來研究發現，Exendin-4除調節血糖外，對保護血管內皮、調節脂質代謝等均有積極作用，表明其在動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的防治方面具有潛在價值[2]。因此，本研究觀察Exendin-4對高脂飲食載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E gene knockout，ApoE-/-)小鼠脂代謝、白細胞介素-6(interlenkin-6，IL-6)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)及血管內皮細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1)表達的影響，初步探討其抗動脈粥樣硬化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 ApoE-/-小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號：SCXK-京-2012-0001)；Exendin-4購自MedChem Express公司；普通飼料購自武漢萬千佳興生物科技有限公司，高脂飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司(H1014，含21%乳脂、0.15%膽固醇)。逆轉錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)試劑盒購自TIANGEN公司；IL-6抗體、MCP-1抗體和VCAM-1抗體及β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司；酶聯免疫反應試劑盒購自上海聯碩生物科技公司；其他試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2 分組及給藥 選用清潔級7～8周的雄性ApoE-/-小鼠40只，體重22～25 g，適應性飼養1周后，隨機分為普通飲食組(10只)和高脂飲食組(30只)，喂養8周后再將高脂飲食組隨機分為非藥物干預組、Exendin-4低劑量組、Exendin-4高劑量組，每組10只。Exendin-4低劑量組、Exendin-4高劑量組ApoE-/-小鼠分別給予20 μg/(kg·d)、 100 μg/(kg·d)Exendin-4腹腔內注射；普通飲食組、非藥物干預組ApoE-/-小鼠給予0.1 mL生理鹽水腹腔內注射。小鼠定期測量體重，調整用藥量。本實驗經湖北醫藥學院動物管理委員會依據湖北醫藥學院動物實驗室動物準則批準。

1.3 標本的采集及處理 實驗動物連續喂養12周。取材前禁食12 h，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，摘除眼球采血，室溫靜置1 h，4 000 r/min常溫離心10 min，收集上清并置于-80 ℃冰箱保存。取血完畢后，迅速開胸，取胸腹主動脈全長，用0.9%氯化鈉沖洗干凈，置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 血液生化檢測 采用全自動生化分析儀檢測總膽固醇(cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平。

1.5 RT-PCR分析小鼠主動脈IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA水平 取凍存于-80 ℃冰箱的小鼠主動脈組織，按試劑盒提取總RNA，利用260 nm及280 nm吸光度計算RNA的純度及濃度，取總RNA逆轉錄為cDNA，按RT-PCR試劑盒進行PCR反應，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列為：β-actin 上游5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′；IL-6上游5′-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3，下游5′-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3′；MCP-1上游5′-TTCTTCGATTTGGGTCTCCTTG-3′，下游5-GTGCAGCTCTTGTCGGTGAA-3′；VCAM-1上游5′-AGTTGGGGATTCGGTTGTTCT-3′，下游5′-CCCCTCATTCCTTACCACCC-3′。反應條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行32個循環。反應結束后，取各組PCR產物8 μL，經1%瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓電泳20 min，凝膠成像儀攝像，計算目標條帶灰度，并以β-actin的灰度作為標準對比。

1.6 Western Blot檢測小鼠主動脈IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白表達 取凍存于-80 ℃冰箱的小鼠主動脈置入含蛋白酶抑制劑及RIPA裂解液中勻漿，勻漿液于4 ℃ 14 000 r/min離心15 min，取上清收集蛋白并測定蛋白濃度，將上樣總蛋白調至一致。蛋白經10% SDS-PAGE電泳，并轉印IL-6、MCP-1及VCAM-1至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，用相應的特異性一抗4 ℃孵育過夜，再經洗膜，然后孵育相應二抗室溫2 h后，采用堿性磷酸酶顯色試劑盒顯影，Image-Pro Plus 6.0軟件分析目標條帶的累積光密度值，并與內參β-actin比較。

1.7 小鼠血清IL-6、MCP-1及VCAM-1水平檢測 采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒進行操作，顯色終止后于450 nm及630 nm波長測量吸光度，通過建立標準曲線計算出樣品濃度。

2 結 果

2.1 Exendin-4對小鼠血脂水平的影響 與普通飲食組比較，非藥物干預組小鼠TC、LDL-C水平明顯增高(P<0.01)，提示高脂飲食可明顯加劇ApoE-/-小鼠脂質代謝紊亂。與非藥物干預組相比，Exendin-4高劑量組小鼠TC及LDL-C水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。各組小鼠TG及HDL-C水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 Exendin-4對小鼠血清脂質水平的影響(±s) mmol/L

與普通飲食組比較，1)P<0.01；與非藥物干預組比較，2)P<0.05，3)P<0.01；與Exendin-4低劑量組比較，4)P<0.05，5)P<0.01

2.2 Exendin-4對小鼠主動脈IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA表達的影響 以β-actin作為對照，與普通飲食組相比，非藥物干預組IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA相對表達量均明顯增高(P<0.01)，給予Exendin-4處理后，Exendin-4低劑量組、Exendin-4高劑量組IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA表達較非藥物干預組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且Exendin-4高劑量組IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA表達低于Exendin-4低劑量組(P<0.01)。詳見圖1、表2。

A為普通飲食組；B為非藥物干預組；C為Exendin-4低劑量組；D為Exendin-4高劑量組

組別 只數 IL-6 mRNA MCP-1 mRNAVCAM-1 mRNA普通飲食組10 1.00±0.01 1.01±0.08 1.00±0.02 非藥物干預組 10 1.99±0.121) 2.08±0.211) 1.68±0.291)Exendin-4低劑量組 10 1.69±0.072) 1.91±0.682) 1.51±0.412)Exendin-4高劑量組 10 1.39±0.053)4) 1.23±0.843)4) 1.29±0.673)4)

與普通飲食組比較，1)P<0.01；與非藥物干預組比較，2)P<0.05，3)P<0.01；與Exendin-4低劑量組比較，4)P<0.01

2.3 Exendi-4對小鼠主動脈IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白表達的影響 與普通飲食組相比，非藥物干預組IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白的表達量明顯增加(P<0.01)。Exendin-4低劑量組、Exendin-4高劑量組IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白表達較非藥物干預組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且Exendin-4高劑量組IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白表達低于Exendin-4低劑量組(P<0.05或P<0.01)。詳見圖2、表3。

A為普通飲食組；B為非藥物干預組；C為Exendin-4低劑量組；D為Exendin-4高劑量組

表3 各組小鼠主動脈IL-6、MCP-1及VCAM-1 蛋白表達情況(±s)

與普通飲食組比較，1)P<0.01；與非藥物干預組比較，2)P<0.05，3)P<0.01；與Exendin-4低劑量組比較，4)P<0.05，5)P<0.01

2.4 Exendi-4對小鼠血清IL-6、MCP-1和VCAM-1水平的影響 普通飲食組小鼠血清中IL-6、MCP-1和VCAM-1水平均較低，非藥物干預組小鼠血清中IL-6、MCP-1和VCAM-1水平較普通飲食組明顯升高(P<0.01)，提示高脂飲食可明顯加劇ApoE-/-小鼠炎癥反應。給予Exendin-4處理后，Exendin-4低劑量組、Exendin-4高劑量組血清中IL-6、MCP-1和VCAM-1水平較非藥物干預組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且Exendin-4高劑量組血清中VCAM-1水平低于Exendin-4低劑量組(P<0.01)。詳見表4。

表4 Exendin-4對小鼠血漿IL-6、MCP-1和VCAM-1含量的影響(±s)

與普通飲食組比較，1)P<0.01；與非藥物干預組比較，2)P<0.05，3)P<0.01；與Exendin-4低劑量組比較，4)P<0.01

3 討 論

既往研究表明，在動脈粥樣硬化發生發展過程中，脂質代謝紊亂和炎癥反應是相伴而生的，炎癥可導致脂質代謝紊亂，脂質代謝紊亂又可加重炎癥反應[3]。因此，對動脈粥樣硬化的有效防治，需要對脂質代謝進行調節，同時抑制促炎因子的表達或促進抗炎因子的表達。

載脂蛋白是血漿脂蛋白的重要組成部分，在機體脂質尤其是總膽固醇的代謝中發揮著極其重要的作用[4]。ApoE-/-小鼠能自發形成與人類相似病理特征的動脈粥樣硬化斑塊，是研究動脈粥樣硬化病理過程的良好動物模型，高脂飲食可以明顯促進動脈粥樣硬化的進程[5]。

本研究選擇IL-6、MCP-1和VCAM-1作為動脈粥樣硬化炎癥反應的指標。IL-6是一種多功能炎癥細胞因子，具有廣泛生物學特性。當血管內皮功能受損時，IL-6可不同程度升高，并通過刺激巨噬細胞分泌MCP-1，從而上調基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)表達，加重血管壁炎癥反應[6]。同時，IL-6可以誘導血小板源性生長因子的生成從而促進平滑肌細胞增殖，進而促進動脈粥樣硬化的進展[7]。MCP-1作為趨化性細胞因子超家族CC亞家族中的一員，是炎癥反應發生的主要趨化因子之一，在炎癥反應發生時，促進單核細胞穿過內皮，進入內皮下，逐步分化成為巨噬細胞進而演變成為泡沫細胞，形成動脈粥樣硬化早期脂肪條紋病變[8]。VCAM-1又名CD106，屬于免疫球蛋白超家族，主要表達于血管內皮細胞、巨噬細胞及平滑肌細胞表面[9]。在病理因素刺激下，內皮細胞高表達VCAM-1，VCAM-1不僅促使白細胞向炎癥部位募集，同時又可以被白細胞介素-1(interlenkin-1，IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎癥因子激活，形成級聯反應，因此VCAM-1被認為是炎癥反應的早期事件，同時是動脈粥樣硬化的病理基礎[10]。Exendin-4是GLP-1受體激動劑，最初從美國毒蜥唾液中分離得到的含有39個氨基酸的多肽，與哺乳動物GLP-1有53%同源性，和胰高血糖素樣肽受體1(glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R)結合產生相應的生物學效應[11]。研究表明，Exendin-4可通過控制血糖、改善體脂分布，減少心血管并發癥的發生[12]。Arakawa等[13]研究表明，Exendin-4可明顯減少單核/巨噬細胞在血管壁上的聚集，并最終抑制動脈粥樣斑塊的形成。

本研究主要探討Exendin-4對高脂飲食ApoE-/-小鼠脂質代謝及炎癥因子表達的影響，結果發現，高脂飲食可明顯加劇ApoE-/-小鼠血脂代謝紊亂，應用Exendin-4處理后，可改善TC及LDL-C水平，但對TG及HDL-C水平無明顯影響，可能與實驗動物的不同生理狀態及給藥時間長短有關。同時，通過檢測小鼠主動脈及血漿中IL-6、MCP-1及VCAM-1 表達水平，發現Exendin-4干預能明顯抑制炎癥因子的基因及蛋白表達。

本研究結果表明，Exendin-4處理可明顯改善高脂飲食ApoE-/-小鼠TC及LDL-C水平，并下調IL-6、MCP-1及VCAM-1基因及蛋白表達水平。這可能是Exendin-4穩定動脈粥樣硬化斑塊、抗動脈粥樣硬化作用機制之一。