砒砂巖中植物促生芽孢桿菌的篩選及其對土壤的改良作用

鄧 琳，王 濤，殷涂童，何琳燕，楊才千，梁止水

（1.東南大學 土木工程學院，江蘇 南京211189；2.農業部農業環境微生物重點實驗室 南京農業大學 生命科學學院，江蘇 南京210095）

中國砒砂巖區域約為1.67×104km2，主要分布在以內蒙古鄂爾多斯市準格爾旗為中心的晉陜蒙接壤區［1］。裸露的砒砂巖地區生態環境脆弱，水土流失嚴重，養分含量低，植物難以生長［2］。國內外學者采用了一些生物措施和工程措施，以期解決該地區的植被恢復、土壤改良、水土保持等問題［3-4］。畢慈芬等［5］在砒砂巖區溝床種植沙棘、形成柔性淤地壩是防治溝床下切的有效生物措施之一。肖培青等［6］通過分析砒砂巖巖石成分，研發了砒砂巖改性材料，于2015年建設了一座砒砂巖改性材料淤地壩示范工程。姚文藝等［7］研究了一種環境友好型抗蝕促生技術，使砒砂巖區產沙量減少90%以上。從整體來看，如何通過新的技術手段改善植被立地條件，緩解有機質和速效磷等植物生長限制因子，有效防治水土流失，仍是當前砒砂巖土壤改良亟待解決的關鍵技術。

微生物廣泛分布于各種環境中，在一定條件下有利于植物生長。生活在土壤、植物根際或內部的植物促生細菌（plant growth promoting bacteria，簡稱PGPB）在農業生產和環境保護領域有很好的應用前景［8-10］。目前已鑒定出多種PGPB菌株，主要種類包括 芽 孢 桿 菌 屬（Bɑcillus）、假 單 胞 菌 屬（Pseudomonɑs）、固氮菌屬（Azotobɑcter）、固氮螺菌屬（Azospirillum）等。芽孢桿菌是一類能夠產生芽孢、抗逆性較強的細菌，多數菌株能夠固氮、溶磷，并產生生長素等植物激素，能提高植物對干旱、高鹽和重金屬的抗逆性［11］。砒砂巖土壤中的芽孢桿菌種群及其促生特性還有待挖掘，國內外對于芽孢桿菌應用于砒砂巖土壤改良的設想也是鮮有報道。

本研究從砒砂巖區域采集土壤和植物樣品，分離篩選抗逆性強的芽孢桿菌，探究植物促生芽孢桿菌的生物學特性和改善砒砂巖土壤性質的作用，從而為利用PGPB來改善砒砂巖區植被立地條件和防治水土流失的科學設想提供生物資源和試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品為砒砂巖區域道路邊坡土壤、煤礦排土場土壤和苜蓿根系。

LB 培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，水1 000 ml，p H 值7.0。固體培養基中添加20 g瓊脂。

供 試 植 物：黑 麥 草（Lolium perenne），苜 蓿（Medicɑgo sɑtivɑ），種子購自南京市棲霞區春茵種子有限公司。

1.2 砒砂巖土壤和植物內生芽孢桿菌的分離篩選

采用熱處理和選擇性培養基分離、純化芽孢桿菌。參考楊麗等［12］和龐海東等［13］的方法，稱取采集的土樣1 g，放入盛有99 ml無菌水的錐形瓶中，充分振蕩。再放入85 ℃恒溫水浴鍋中水浴15 min，制成濃度為1／100的土壤懸液。再吸取1 ml土壤懸液加到9 ml的無菌水試管中，混勻，依次梯度稀釋后，分別取0.1 ml稀釋液涂布在LB 固體培養基上。培養72 h后選取菌落數適量的平板，隨機挑取長勢良好的單菌落，多次劃線分離純化，保存待用。

將植物根部用熱的去離子水沖洗干凈，用75%的酒精和2.5%的NaClO 先后消毒，并用無菌水浸洗數次。將表面消毒的根部0.1 g置于無菌研缽內研磨至勻漿，加1 ml無菌水混勻，再放入85 ℃恒溫水浴鍋中水浴15 min。取0.1 ml懸液涂布于LB固體培養基上，同時取最后一遍浸洗的無菌水0.1 ml涂布于LB固體培養基，以檢測樣品表面消毒是否徹底。28 ℃培養72 h 后，若無菌水涂布的平板未長菌，則從LB 平板上挑選長勢良好的單菌落，多次劃線分離純化后4 ℃保存。

1.3 菌株的生物學特性測定

將分離純化得到的芽孢桿菌接種至LB 液體培養基中培養至對數期，吸取50μl菌液轉接到液體LB培養基試管中靜置3 d，觀察生物膜產生的情況。挑選產生物膜能力強的菌株于4 ℃保存。

菌株產吲哚乙酸（IAA）測定參考Gordon等［14］的方法，鐵載體能力測定參考Schwyn等［15］的方法。菌株的鑒定采用16S r RNA 基因序列同源性分析，參考Xi等［16］方法提取細菌總DNA 和PCR 擴增16S r RNA 基因產物，將16S r RNA 基因擴增產物送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。用BLAST 軟件將所獲得序列與GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）和Ez Taxon（http：∥www.eztaxon.org）中已知的16S r RNA 基因序列進行比對分析，采用MEGA7.0構建系統進化樹。

1.4 菌株對砒砂巖的改良作用

將供試菌株接種于LB液體培養基中，30℃，150 r／min振蕩培養至OD600為1.0（約1.00×108CFU／ml）時，取菌液20 ml加到120 g砒砂巖土壤中（土壤置于塑料杯中），對照添加等量LB 培養基。再加水10 ml，用保鮮膜覆蓋于塑料杯口，保持土壤的濕度，靜置一個月。

采用梯度稀釋、平板培養的方法計算土壤中細菌總數。采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法［17］測定砒砂巖土壤中蔗糖酶活性，以24 h后1 g土壤葡萄糖的毫克數表示。參照《土壤農化分析》［18］，采用重鉻酸鉀容量法—稀釋熱法測量土壤中有機質的含量。采用0.5 mol／L Na HCO3浸提—鉬銻抗比色法測量土壤中速效磷的含量。采用NH4OAc浸提—火焰光度法測定土壤中速效鉀的含量。

1.5 菌株對苜蓿和黑麥草生長的影響

供試土壤采自內蒙古砒砂巖區，布置盆栽試驗，每個穴盤裝200 g砒砂巖土壤，并向穴盤中添加去離子水20 g，使整個土壤環境保持一定的干旱程度。用5%的次氯酸鈉溶液對黑麥草和苜蓿種子表面消毒20 min，均勻地灑在鋪有濕潤無菌紗布的培養皿中，放置于30℃黑暗培養箱中催芽。挑取大小一致露白后的種子播種于育苗盤，當種子芽長到1 cm 左右時，挑選長勢均勻的黑麥草和苜蓿幼苗，用1.4方法制備的菌懸液蘸根處理30 min，對照浸泡無菌LB培養基。蘸根結束后將幼苗移栽至穴盤中，每個處理3個重復。隔半個月后再接種20 ml菌懸液處理，對照接種等量無菌LB培養基。一個月后測量黑麥草和苜蓿的地上部干重和根部干重，以評判菌株對植物的促生效果。

1.6 統計分析

所有試驗數據均采用Microsoft Office Excel 2010軟件作圖，采用SPSS 25.0 對數據進行單因素方差分析，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 供試芽孢桿菌的生物學特性

從砒砂巖土壤和苜蓿中共分離得到12株芽孢桿菌，其來源見表1，菌落形態如圖1 a所示。

表1 供試芽孢桿菌的來源和促生特性

12株芽孢桿菌的菌落均為圓形，顏色介于乳白色和淡黃色之間。菌株P75和P23的菌落是半透明的，其余菌落均為不透明。菌株P76，C47，C48 和F84菌落邊緣不整齊；菌株F83，G36，B29，G37，C48和P77 菌落表面褶皺較為豐富，其余菌株的菌落表面光滑、濕潤。

圖1 供試芽孢桿菌的菌落形態（a）和形成的生物膜（b）

供試芽孢桿菌在LB 液體培養基表面上均能形成生物膜（圖1b）。除菌株P23的生物膜較少之外，其余菌株產生物膜的能力都很強。菌株能夠在液體LB培養基和空氣交匯的界面處產生厚厚的一層膜，產膜細菌主要生存和聚集在這層膜中，所以下層LB培養基比較澄清，而產膜弱的菌株不能很好地形成生物膜，所以下層LB液體呈渾濁狀。生物膜的產生可以提高菌株對不良環境的抗逆性，同時可以提高菌株在植物根系的定殖能力［19-20］。

植物促生細菌在其生長代謝過程中能夠產生一些促進植物生長發育的化合物，其中IAA 被認為能夠使植物產生更多的次級根和不定根，促進植物生長；鐵載體被認為能夠結合鐵離子，緩解植物在不良環境下缺鐵的癥狀，促進植物的生長［8］。供試芽孢桿菌的促生特性如表1所示。這些芽孢桿菌都能產生鐵載體和吲哚乙酸（indole acetic acid，IAA）。除菌株P76以外，其他菌株產鐵載體的含量均很高，尤其是菌株F84的鐵載體產量達到＋＋＋＋＋。不同菌株的IAA 產量在18.3～49.5 mg／L 之間，其中菌株P75的IAA 產量最低，F83的IAA 產量最高。

以菌株總DNA 為模板，采用通用引物進行PCR擴增16S r DNA，PCR 產物經純化、測序，用BLAST軟件將序列與GeneBank 中參比菌株的16S r DNA序列進行比對，構建的系統發育樹如圖2所示。菌株F83，F84，P75，P76 和P77 均 與B.hɑlotolerɑns 相近，同源性達到99.9%，且P75與F83，P76與P77更相近，同源性為100%，歸為B.hɑlotolerɑns同一種。菌株C46，C47，C48 與B.siɑmensis 相近，而B29，G36，G37與B.ɑtrophɑeus的同源性更近，同源性為99.9%。P23 與其他篩選菌株的同源性都較遠，與B.zhɑngzhouensis的同源性為99.9%。

2.2 供試芽孢桿菌對砒砂巖土壤特性的影響

有機質、速效磷和速效鉀在一定程度上能夠反映土壤肥力［18］。由圖3 可知，接菌處理可以影響砒砂巖土壤有機質、速效磷和速效鉀含量。如圖3a所示，與對照（CK）相比，除菌株B29，C46，C48 和P23 以外，9株供試芽孢桿菌都能夠顯著增加砒砂巖土壤的有機質含量（5.0%～24.7%），尤其是菌株G37 和P75處理的砒砂巖土壤有機質含量分別顯著增加了23.9%和24.7%（p＜0.05）。

圖2 基于供試芽孢桿菌16S rDNA序列構建的系統發育樹

如圖3b所示，除菌株B29，C46，G36和G37以外，其他菌株均能顯著提高砒砂巖土壤中速效磷的含量（7.2%～17.1%，p＜0.05），尤其是菌株C47，F84，P23，P75和P77能夠使速效磷含量顯著提高10%以上。

此外，與未接菌對照相比，菌株C48，F83，P75和P77能夠顯著提高砒砂巖土壤的速效鉀含量（圖3c），其中菌株F83和P75處理可使速效鉀含量分別顯著增加13.3%和21.0%。

圖3 供試菌株對砒砂巖土壤有機質含量（a）、速效磷含量（b）和速效鉀（c）的影響

如圖4a所示，與未接菌對照相比，C46，C47 和C48菌株處理沒有增加砒砂巖土壤可培養細菌數量，除此以外，其他菌株都增加了砒砂巖土壤中的可培養細菌數量，其中接種B29，F83，G36，P23，P75，P76和P77菌株的砒砂巖土壤中可培養細菌數量均超過107CFU／g，且數量差異表現為：P23＞P77＞P75＞P76＞F83＞B29＞G36。

蔗糖酶活性反應了土壤有機碳積累與分解轉化的規律，蔗糖酶活性的提高有助于土壤的改良［17］。如圖4b所示，接菌處理能夠改變砒砂巖土壤中蔗糖酶的活性。與對照相比，B29，C46，F83，F84，P75，P76和P77菌株能夠顯著提高土壤蔗糖酶活性（42.4%～65.7%，p＜0.05），其中，菌株C46，F83，P75 和P76處理的砒砂巖土壤蔗糖酶活性顯著增加了50%以上。

2.3 供試芽孢桿菌對苜蓿和黑麥草的促生作用

供試芽孢桿菌在不同植物上的促生效果表現出差異（如表2所示）。與對照相比，在砒砂巖土壤中菌株F83，P75和P76能促進苜蓿根部干重增加明顯（81.7%～86.1%，p＜0.05），但苜蓿地上部干重增加量差異不顯著。此外菌株P75能夠顯著增加黑麥草的地上部干重（22.3%）和根部干重（29.9%，p＜0.05）。由此可見，菌株P75對苜蓿和黑麥草均有促生作用。

3 討論

植物根際促生細菌是土壤生態系統中的活躍組分，影響著土壤有機質的轉化和養分循環，在促進植物多樣性形成、退化生態系統的恢復與重建過程中具有十分重要的作用［21］。迄今為止，國內外已發現的植物促生細菌以芽孢桿菌和假單胞菌為主，芽孢桿菌以其抗逆性強等優點又成為了農業和環境應用領域的熱點之一。砒砂巖土壤無水堅硬如石，遇水松軟如泥，對該特殊土壤中微生物種群的調查研究較少。

圖4 接菌處理對砒砂巖土壤可培養細菌數量（a）和蔗糖酶活性（b）的影響

表2 供試芽孢桿菌對苜蓿和黑麥草的地上部和根部干重的影響

本研究從砒砂巖土壤和苜蓿中篩選產生IAA、鐵載體和生物膜的芽孢桿菌，發現這12株芽孢桿菌可以分為4個類群，具有功能多樣性、遺傳多樣性和種群多樣性，為植物促生細菌資源挖掘和改良砒砂巖土壤肥力提供了豐富的菌株資源。

砒砂巖區域土壤肥力低下，植物難以生長，成為黃土高原侵蝕最劇烈、治理難度最大的地區，因此提高土壤肥力是改良砒砂巖的重要環節之一。土壤肥力包括土壤物理、化學和生物學性質，有機質、速效磷鉀含量和土壤酶活性是其重要指標［18］。砒砂巖土壤有機質含量通常較低［22］。本研究中有9個接菌處理組顯著增加了砒砂巖土壤的有機質含量（5.0%～24.7%），而對照組因為添加了以胰蛋白胨和酵母提取物為主的LB培養基，有機質含量增加達到11.2 g／kg，說明添加有機質和接菌處理可以在一定時間內快速提高砒砂巖土壤的有機質含量。菌株P75增加土壤有機質含量的作用更顯著，可能與接菌處理后可培養細菌數量和蔗糖酶活性顯著增加有關，因為細胞通常富含有機質，蔗糖酶可以促進土壤有機碳轉化。

砒砂巖區域的植被恢復和重建是防治水土流失的重要工程，沙棘、紫花苜蓿、檸條錦雞兒和多年生黑麥草等植物被大量試種［22-25］，考慮到多年生黑麥草根系發達、紫花苜蓿能夠固氮增肥，選作本研究的供試植物材料。在實驗室條件下B.hɑlotolerɑns P75菌株能夠促進黑麥草和苜蓿幼苗在砒砂巖土壤中的生長，其他菌株的促生作用不顯著。通常認為能夠分泌IAA 和鐵載體的細菌具有良好的促生作用，但本研究中F83和F84產生較多IAA 和鐵載體，其對苜蓿和黑麥草的促生作用一般，而產生IAA 和鐵載體較少的P75菌株促生作用最好，由于P75菌株分離自生長于砒砂巖土壤中苜蓿內，可能更適應植物。此外，植物促生芽孢桿菌P75對植物生長和修復砒砂巖土壤的影響也會受多種因素共同作用，其促生作用機制和改良砒砂巖的工程化應用還需進一步研究。

4 結論

砒砂巖地區的水土流失引起了嚴重的環境生態問題，其修復治理涉及化學、物理、植物、農業、生態和工程等諸多方面。植物措施在一定程度上減少水土流失，但有局限性，利用植物促生細菌強化植物修復，有望發展修復治理砒砂巖土壤的新途徑。本文從內蒙古典型砒砂巖土壤和當地優勢植物中篩選得到12株產生IAA，鐵載體和生物膜的芽孢桿菌，反映出砒砂巖土壤細菌的生物多樣性。其中B.hɑlotolerɑns P75菌株可以提高砒砂巖土壤的有機質含量、速效磷鉀含量和可培養細菌數量，增強土壤蔗糖酶活性，還能促進苜蓿和黑麥草在砒砂巖土壤中生長，為微生物強化植物改良砒砂巖土壤提供了理論依據和生物資源。