渝東南地區土家特色酸鲊肉純種發酵前期發酵條件優化

冉春霞 陳光靜 鄧惠玲

摘 要：采用響應面法優化渝東南地區土家特色酸鲊肉純種發酵前期的發酵條件，在單因素試驗的基礎上，選取發酵時間、發酵溫度、菌種接種量及白砂糖添加量為影響因子，以酸鲊肉前期發酵制品的乳酸脫氫酶活力、蛋白酶活力、脂肪酶活力為響應值，應用Box-Behnken試驗設計建立數學模型。結果表明，酸鲊肉前期發酵的最優工藝條件為發酵時間30 h、發酵溫度34 ℃、菌種接種量8%、白砂糖添加量4%，在此工藝條件下，得到酸鲊肉前期發酵制品的乳酸脫氫酶活力為102.92 U/mL，蛋白酶活力為41.58 U/mL，脂肪酶活力為11.86 U/mL，各評價指標達到相對較高水平。

關鍵詞：酸鲊肉;純種發酵;前期發酵;發酵條件優化

Abstract： Response surface methodology （RSM） was applied to optimize the pure culture per-fermentation conditions for Suanzharou. Using one-factor-at-a-time method， fermentation time， temperature， inoculum amount and sucrose addition were chosen as independent variable and the activities of lactate dehydrogenase， protease and lipase as response values. A mathematical model was established using the Box-Behnken experimental design. The optimal fermentation conditions were determined as follows： fermentation time 30 h， fermentation temperature 34 ℃， inoculum amount 8%， and sucrose addition 4%. Under these optimal conditions， the activities of lactate dehydrogenase， protease and lipase were 102.92， 41.58 and 11.86 U/mL， respectively， which were all desirable for Suanzharou processing

Keywords： Suanzharou; pure culture fermentation; pre-fermentation; optimization of fermentation conditions

“鲊”是用米粉、面粉等加鹽和其他佐料拌制的切碎的菜，可貯藏，如酸鲊辣椒、酸鲊肉、酸鲊魚等。酸鲊肉屬于“鲊”的一種，是我國少數民族地區的傳統特色發酵食品，其制作具有悠久的歷史，2 000多年前的史書《齊民要術》中就有關于它的記載。在我國重慶、貴州、四川、湖南、廣西的土家族、苗族、侗族、傣族及毛南族等少數民族地區被廣泛食用，然而，不同地域、不同民族的人在酸鲊肉制作過程中所采用的原輔料和發酵工藝有所差別，因而形成不同的地域風味，同時也賦予酸鲊肉濃郁的民族特色。渝東南地區傳統土家特色酸鲊肉是一種以新鮮豬五花肉為原料，將原料肉洗凈后切片，然后將其與米粉、辣椒、食鹽等輔料按一定比例混勻，裝入壇子里，在自然條件下利用微生物的厭氧發酵作用而形成的一種乳酸菌型發酵肉制品[1]，具有肉質細膩、風味獨特、肥而不膩等特點以及降血清膽固醇、調節胃腸道、抗氧化等生理保健功能[2-4]。經傳統工藝制作的酸鲊肉可存放較長時間，這可能是由高鹽含量、乳酸菌發酵產酸和細菌素、香辛料和茶葉等輔料含生物堿、茶多酚及黃酮類物質、嚴格的厭氧發酵環境等多重柵欄因子的綜合作用所致[5-9]。但酸鲊肉的傳統制作方式為自然發酵，生產差異性和隨機性較大，發酵菌種和發酵條件難以控制，導致每批產品的品質不穩定;難以避免雜菌生長產生生物胺、亞硝酸鹽等有毒、有害物質，危害食品安全，不適合工業化、規模化生產，嚴重影響酸鲊肉的產業化發展[10-13]。

純種發酵是19世紀中后期，發酵生物學說建立后產生的[14]。現代發酵工業大多采用純種發酵，它具有使有益菌快速生長、過程控制簡單、目標產物生成速率快及減少有害物質積累等優點，可以解決傳統發酵產品發酵過程中存在的上述問題，符合大批量生產的快速、易控要求，更適合工業化生產。在酸鲊肉發酵過程中，前期發酵主要是培養乳酸菌的過程，乳酸菌生長過程中分泌和積累一定量的乳酸脫氫酶、蛋白酶、脂肪酶等酶系，乳酸脫氫酶是糖酵解過程中重要的氧化還原酶，可以催化丙酮酸還原產生乳酸，從而賦予酸鲊肉特殊的酸味，同時pH值降低可以抑制雜菌生長、促進發色、降低亞硝酸鹽殘留和亞硝胺含量等[15-18];蛋白酶、脂肪酶等酶系在后期發酵中的協同作用可以提高酸鲊肉的營養價值，促進其獨特風味的形成。但乳酸菌生長過程中產生酶系的活力受到發酵時間、發酵溫度、乳酸菌接種量、糖添加量等因素的影響，因此，本研究采用響應面法優化酸鲊肉純種發酵前期的發酵條件，這對實現酸鲊肉的工業化生產有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬五花肉、米粉、白砂糖 重慶萬州永輝超市。

植物乳桿菌（編號CICC21801） 中國工業微生物菌種保藏中心;蛋白胨、牛肉膏、酵母膏（均為生化試劑）、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、檸檬酸二銨、乙酸鈉、蔗糖、吐溫-80、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、碳酸鈣、丙酮酸鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、體積分數85%磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、濃溴水、無水碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、干酪素、酪氨酸、聚乙烯醇（polyving akohol（PVA）、聚合度（1 750±50））、橄欖油、氫氧化鈉、酚酞、體積分數95%乙醇（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠;還原型輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）（優級純）? ?法國生物梅里埃公司;MRS瓊脂培養基 北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

BHC-1300ⅡA/B2生物潔凈安全柜 浙江蘇凈凈化設備有限公司;DHP-9602電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;YX-280A手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫療器械有限公司;PTX-FA300電子分析天平 美國康州HZ電子科技有限公司;Hitech-Kflow超純水儀 上海和泰儀器有限公司;DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠;T6紫外-可見分光光度計?北京普析通用儀器有限責任公司;GTR16-2高速冷凍離心機 北京時代北利離心機有限公司;KQ-100E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;XMTD-204數顯式恒溫水浴鍋 上海躍進醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基配制

MRS液體培養基配制[19]：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉5 g、蔗糖20 g、吐溫-80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、碳酸鈣1 g、蒸餾水1 000 mL、pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌15～20 min。

1.3.2 菌懸液制備

凍干菌→全部溶解于0.5 mL MRS液體培養基→轉入MRS液體培養基中活化（（36±1） ℃培養24～48 h）2～3 代→接入500 mL MRS液體培養基中擴大培養（（36±1） ℃培養24～48 h）→再經過8 000 r/min、4 ℃、10 min離心后用無菌生理鹽水配制得到1×106～1×108 CFU/mL的菌種懸浮液→備用

1.3.3 前期發酵制品的制備

將豬肉切成片狀，加入一定量的米粉和白砂糖，混勻后在紫外燈下進行滅菌處理（30 min）;然后將制備的菌懸液以噴灑的方式均勻接種到發酵原料上，接種量為8%（均為質量分數，下同），然后置于30 ℃條件下培養36 h，即得酸鲊肉的前期發酵制品。

1.3.4 粗酶液的制備

1.3.4.1 乳酸脫氫酶粗酶液的制備

準確稱取充分研磨的前期發酵制品5 g，加入4 ℃預冷的pH 6.5磷酸緩沖液（m/V=1∶4），研磨破碎10 min，再用磷酸緩沖液將研磨后樣品轉入容量瓶并定容至100 mL，用紗布過濾，濾液在4 ℃條件下10 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為乳酸脫氫酶粗酶液[20]。

1.3.4.2 蛋白酶粗酶液的制備

準確稱取充分研磨的前期發酵制品5 g，加入50 mL蒸餾水，在（40.0±0.5） ℃水浴中間斷攪拌，浸提1 h，轉入容量瓶定容至100 mL，用紗布過濾，濾液3 500 r/min離心5 min，收集上清液，即為蛋白酶粗酶液[21-22]。

1.3.4.3 脂肪酶粗酶液的制備

準確稱取充分研磨的前期發酵制品5 g，加入50 mL pH 7.5的磷酸緩沖溶液，在（40.0±0.5） ℃水浴中間斷攪拌，浸提1 h，轉入容量瓶定容至100 mL，用紗布過濾，濾液3 500 r/min離心5 min，收集上清液，即為脂肪酶粗酶液[22-23]。

1.3.5 前期發酵條件單因素試驗

1.3.5.1 發酵時間對各酶活力的影響

將豬肉切成片狀，按照質量比2∶1加入米粉，再加入4%的白砂糖，混勻后在紫外燈下滅菌處理30 min;將制備的菌懸液以噴灑的方式均勻接種到發酵原料上，接種量為8%，然后置于34 ℃條件下分別培養6、12、18、24、30、36、42 h，測定樣品中乳酸脫氫酶、蛋白酶和脂肪酶的活力。

1.3.5.2 發酵溫度對各酶活力的影響

將豬肉切成片狀，按照質量比2∶1加入米粉，再加入4%的白砂糖，混勻后在紫外燈下滅菌處理30 min;將制備的菌懸液以噴灑的方式均勻接種到發酵原料上，接種量為8%，然后分別置于20、25、30、35、40、45 ℃條件下培養30 h，測定樣品中乳酸脫氫酶、蛋白酶和脂肪酶的活力。

1.3.5.3 接種量對各酶活力的影響

將豬肉切成片狀，按照質量比2∶1加入米粉，再加入4%的白砂糖，混勻后在紫外燈下滅菌處理30 min;將制備的菌懸液以噴灑的方式均勻接種到發酵原料上，接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%，然后分別置于34 ℃條件下培養30 h，測定樣品中乳酸脫氫酶、蛋白酶和脂肪酶的活力。

1.3.5.4 白砂糖添加量對各酶活力的影響

將豬肉切成片狀，按照質量比2∶1加入米粉，再分別加入0%、2%、4%、6%、8%的白砂糖，混勻后在紫外燈下滅菌處理30 min;將制備的菌懸液以噴灑的方式均勻接種到發酵原料上，接種量為8%，然后置于34 ℃條件下培養30 h，測定樣品中乳酸脫氫酶、蛋白酶和脂肪酶的活力。

1.3.6 前期發酵條件響應面優化試驗

采用Design Expert 7.0.0軟件進行Box-Behnken響應面優化試驗設計。根據單因素試驗結果，選取發酵時間、發酵溫度、接種量和白砂糖添加量作為試驗因素，以乳酸脫氫酶、蛋白酶和脂肪酶的活力為響應值，試驗因素及水平見表1。

1.3.7 指標測定

1.3.7.1 乳酸脫氫酶活力

在反應體系中加入磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）2.8 mL、NADH（6 mmol/L）0.1 mL、丙酮酸鈉（30 mmol/L）0.1 mL、粗酶液20 L，25 ℃水浴5 min，測定反應體系在340 nm波長處的吸光度（磷酸鹽緩沖液作為空白）。乳酸脫氫酶活力測定參照Zhao Rui等[20]的方法，將每1 min氧化分解1 mol NADH所需的酶液定義為1 個酶活力單位。

1.3.7.2 蛋白酶活力

參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[21]，采用福林法進行測定。

1.3.7.3 脂肪酶活力

參照GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》[23]，采用PVA-橄欖油乳化液水解滴定法進行測定。

1.4 數據處理

采用Sigma Plot軟件對數據進行分析和處理，每一指標均平行測定3 次;采用Design-Expert 7.0.0軟件中的Response Surface（Box-Behnken試驗設計）建立數學模型;采用方差分析對數據進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 酸鲊肉前期發酵條件單因素試驗結果

2.1.1 發酵時間對酸鲊肉前期發酵制品中各酶活力的影響

由圖1可知，采用植物乳桿菌發酵原料肉時，酸鲊肉前期發酵制品中蛋白酶和脂肪酶活力在發酵30 h時達到最大，分別為40.80、11.85 U/mL，乳酸脫氫酶活力在發酵24 h時達到最大，為108.20 U/mL。綜合考慮各酶系的酶活力情況，選擇發酵時間為24～36 h較為適宜。

小寫字母不同，表示同種酶不同組別酶活力差異顯著（P<0.05）。圖2～4同。

2.1.2 發酵溫度對酸鲊肉前期發酵制品中各酶活力的影響

發酵溫度是影響純種發酵酸鲊肉制品品質的重要因素之一，溫度過高或過低均會影響植物乳桿菌的生長，適宜的培養溫度是植物乳桿菌正常生長的重要保證[24-25]。由圖2可知，酸鲊肉前期發酵制品中乳酸脫氫酶活力在發酵溫度30 ℃時最高，為109.20 U/mL，蛋白酶和脂肪酶活力在發酵溫度35 ℃時最高，分別為41.10、11.59 U/mL。因此，選擇發酵溫度為30～40 ℃較為適宜。

2.1.3 接種量對酸鲊肉前期發酵制品中各酶活力的影響

由圖3可知，當接種量從2%增加到8%時，酸鲊肉前期發酵制品中各酶活力逐漸升高，隨著接種量繼續增加，各酶活力開始下降，這可能是由于接種量過大時，單位體積內植物乳桿菌數也相應增加，其生長需要消耗的營養物質越多，菌體之間形成競爭關系，導致其較早衰退，影響產酶量和產酶活力[26-27]。因此，選擇接種量為8%左右較為適宜。

2.1.4 白砂糖添加量對酸鲊肉前期發酵制品中各酶活力的影響

添加可發酵性糖有利于植物乳桿菌發酵產酸[28-29]。由圖4可知，白砂糖添加量為0%～4%時，隨著白砂糖添加量的增加，酸鲊肉前期發酵制品中各酶活力逐漸增加，當白砂糖添加量超過4%后，各酶活力開始下降。這可能是由于白砂糖添加量增加導致發酵體系滲透壓增大，影響植物乳桿菌的生長繁殖，進而影響其產酶量和產酶活力[30];同時，白砂糖添加量過高會導致產品甜度較高而影響適口性。綜合考慮，選擇白砂糖添加量為2%～6%較為適宜。

2.2 酸鲊肉前期發酵條件響應面優化試驗結果

響應面試驗共設置29 個試驗點，其中24 個析因點，5 個中心點，試驗結果見表2。

2.2.1 發酵條件對酸鲊肉前期發酵制品中乳酸脫氫酶活力的影響

以發酵時間（X1）、發酵溫度（X2）、接種量（X3）和白砂糖添加量（X4）為自變量，以乳酸脫氫酶活力（Y1）為因變量，建立回歸模型。所得回歸方程為Y1=101.91-2.85X1-3.59X2+0.40X3+2.72X4-0.25×10-2X1X3+0.87X1X4-7.20×10-2X2X3-0.50X3X4+0.32X12+0.89X22-4.17X32-4.86X42（模型1）。

由表3可知，模型極顯著（P<0.000 1），因變量與所考察自變量之間的線性關系顯著（R2=0.988 9），R2Adj=0.977 8，說明該模型能解釋98.89%響應值的變化，擬合程度較好，失擬項不顯著（P>0.05）。CV表示試驗的精確度，其值越小，試驗結果的可靠性越高，本研究中，CV=0.72%，在可接受范圍內，說明試驗結果可靠，所得二次回歸方程能很好地預測響應值。由回歸方程系數顯著性檢驗可知，模型1的一次項X1、X2和X4影響極顯著（P<0.01），X3影響顯著（P<0.05），二次項X22、X32、X42影響極顯著

（P<0.01），交互項X1X4影響顯著（P<0.05）。

2.2.2 發酵條件對酸鲊肉前期發酵制品中蛋白酶活力的影響

以發酵時間（X1）、發酵溫度（X2）、接種量（X3）和白砂糖添加量（X4）為自變量，以蛋白酶活力（Y2）為因變量，建立回歸模型。所得回歸方程為Y2=41.73+0.29X1-0.61X2+0.24X3+0.21X4-0.25×10-2X1X3-0.52X2X3+0.25×10-2X2X4+0.25×10-2X3X4-1.45X12-1.90X22-1.84X32-1.87X42（模型2）。

由表4可知，模型極顯著（P<0.000 1），因變量與所考察自變量之間的線性關系顯著（R2=0.967 8），R2Adj=0.935 6，說明該模型能解釋96.78%響應值的變化，擬合程度較好，失擬項不顯著（P>0.05）。CV=0.98%，在可接受范圍內，說明試驗結果可靠，所得二次回歸方程能很好地預測響應值。由回歸方程系數顯著性檢驗可知，模型2的一次項X2影響極顯著

（P<0.01），X1、X3影響顯著（P<0.05），二次項X12、X22、X32和X42均影響極顯著（P<0.01），交互項X2X3影響顯著（P<0.05）。

2.2.3 發酵條件對酸鲊肉前期發酵制品中脂肪酶活力的影響

以發酵時間（X1）、發酵溫度（X2）、接種量（X3）和白砂糖添加量（X4）為自變量，以脂肪酶活力（Y3）為因變量，建立回歸模型。所得回歸方程為Y3=11.79+0.21X1+0.22X2+0.074X3+0.23X4+7.20×10-2X1X2+0.05X1X4+0.25×10-2X2X3+0.14X3X4-0.52X12-0.48X22-0.76X32-0.69X42（模型3）。

由表5可知，模型極顯著（P<0.000 1），因變量與所考察自變量之間的線性關系顯著（R2=0.962 4），R2Adj=0.924 9，說明該模型能解釋96.24%響應值的變化，擬合程度較好，失擬項不顯著（P>0.05）。CV=1.44%，在可接受范圍內，說明試驗結果可靠，所得二次回歸方程能很好地預測響應值。由回歸方程系數顯著性檢驗可知，模型3的一次項X1、X2、X4影響極顯著（P<0.01），X3影響顯著（P<0.05），二次項X12、X22、X32和X42均影響極顯著（P<0.01），交互項X2X3影響顯著（P<0.05）。

綜合上述不同發酵條件對酸鲊肉前期發酵制品中乳酸脫氫酶、蛋白酶和脂肪酶酶活力的影響，經軟件優化得出酸鲊肉前期發酵的最佳工藝條件為發酵時間29.89 h、發酵溫度33.95 ℃、接種量8.12%、白砂糖添加量4.31%，此時酸鲊肉前期發酵制品中乳酸脫氫酶活力為103.07 U/mL，蛋白酶活力為41.77 U/mL，脂肪酶活力為11.73 U/mL。

2.3 驗證實驗

為檢驗試驗結果與真實情況的一致性，對上述優化條件進行驗證實驗。同時考慮到實際可操作性，將最佳工藝條件修正為發酵時間30 h、發酵溫度34 ℃、菌種接種量8%、白砂糖添加量4%，在此條件下進行3 次平行實驗，得到酸鲊肉前期發酵制品中乳酸脫氫酶活力為102.92 U/mL，蛋白酶活力為41.58 U/mL，脂肪酶活力為11.86 U/mL，與模型預測值相比相對誤差小于1%。因此，經響應面法優化所得的發酵最佳工藝參數準確可靠，具有實際應用價值。

3 結 論

通過響應面分析建立渝東南地區土家特色酸鲊肉純種發酵前期發酵過程中發酵時間、發酵溫度、菌種接種量和白砂糖添加量與乳酸脫氫酶活力、蛋白酶活力和脂肪酶活力之間的回歸模型，結果表明，模型極顯著，對試驗擬合程度較好，有一定的實用價值。純種發酵酸鲊肉的前期發酵最佳工藝條件為發酵時間30 h、發酵溫度34 ℃、菌種接種量8%、白砂糖添加量4%，在此工藝條件下，酸鲊肉前期發酵制品中乳酸脫氫酶活力為102.92 U/mL，蛋白酶活力為41.58 U/mL，脂肪酶活力為11.86 U/mL，各評價指標達到相對較高水平。

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