紐荷爾臍橙微量元素缺乏癥狀及其葉片光合日變化特性

周高峰，李碧嫻，林華珍，管 冠，劉桂東，姚鋒先，鐘八蓮

（贛南師范大學生命科學學院/國家臍橙工程技術研究中心，江西贛州 341000）

我國是世界重要的柑橘生產國之一，其中臍橙在國內外柑橘生產中占有重要地位。我國臍橙主要集中在贛南—湘南—桂北一線以及長江三峽等地區，這些地區地理和土壤條件一般較差，甚至存在顯著的缺素現象[1-5]。柑橘微量元素缺乏通常發生在新開墾或土層較淺的臍橙園，尤其是砂壤土和堿性土壤柑橘園[6-7]。對柑橘微量元素缺乏的研究較多，尤其是關于Fe、B、Zn 等缺乏的研究[8-10]。如目前種植面積和產量均居全國第一的贛南臍橙產區[11-12]，其主栽的紐荷爾臍橙長期受到土壤缺B 的影響，缺B 比例高達87.1%[4]。王男麒等[13]對贛南地區223 個代表性柑橘園進行背景土壤分析發現，26.0%背景土壤出現缺Cu 現象。另外，范玉蘭等[5]對1405 個贛南臍橙園土壤樣本進行有效Cu 含量分布特征研究發現，極缺和缺乏的臍橙園樣本數為331 個，占樣本總數的23.6%。從葉片診斷角度，凌麗俐等[3]對贛南地區的9 個縣 (市、區)121 個臍橙園的臍橙葉片微量元素進行了分析，結果表明，有95.0%的臍橙葉片Zn 含量處于低量或缺乏水平；贛縣和會昌縣臍橙園葉片Cu 含量主要處于低量水平，分別占55.6%和100.0%；信豐縣臍橙果園則表現為葉片Mn 缺乏，Mn 含量處于低量水平的縣 (市、區) 還有南康市、章貢區、大余縣和會昌縣。與其他果樹一樣，紐荷爾臍橙葉片的光合能力是產量和品質形成的基礎，其干物質的90%以上來自于葉片的光合產物[14]。而微量元素能直接或間接地參與光合作用，其缺乏對葉片的光合特性會產生顯著影響[15]。其影響通常比葉面癥狀更早，因此可以作為微量元素缺乏早期診斷的依據之一。

本研究以贛南臍橙主栽品種紐荷爾臍橙為試材，通過砂培盆栽缺素試驗，研究目前在臍橙生產上常見的缺Fe、Mn、B、Zn 和Cu 現象。首先，通過觀察記錄缺Fe、Mn、B、Zn 和Cu 在不同處理時間和植株不同部位的癥狀，進一步明確紐荷爾臍橙缺素在不同階段的癥狀。其次，通過研究缺Fe、Mn、B、Zn 和Cu 條件下的光合特性，找到早期缺素的特征曲線。通過以上兩方面的工作，以期為田間缺素癥狀的早期診斷提供理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2016 年11 月至翌年9 月在國家臍橙工程技術研究中心基地溫室進行。以2016 年4 月嫁接的1 年生枳 [Poncirus trifoliata (L.) Raf.] 砧紐荷爾臍橙 [Citrus sinensis (L.) Osb. CV. Newhall] 幼苗為材料。

選取生長在相同育苗基質中相對一致的紐荷爾臍橙幼苗，每株小苗保留1 個抽梢，將該梢的葉片定義為老葉，同時對植株根系進行重剪 (促進植株多發須根[16])。然后，用自來水清洗苗木除去根表面的污漬，將植株移栽至裝有8 L 左右石英砂和珍珠巖1∶1 (v∶v) 的黑色塑料盆中，每盆一棵。用略有修改的Hoagland No.2 營養液[17]澆灌。營養液的配方如下:6 mmol/L KNO3、4 mmol/L Ca(NO3)2、1 mmol/L NH4H2PO4、2 mmol/L MgSO4、25 μmol/L H3BO3、9 μmol/L MnCl2、0.8 μmol/L ZnSO4、0.3 μmol/L CuSO4、0.01 μmol/L H2MoO4和 50 μmol/L Fe-EDTA。大棚的溫度控制在22℃～28℃，相對濕度為50%～75%。每2 天澆灌1 次營養液，每次均澆透，即營養液有約500 mL 從盆底流出。

試驗設置5 個處理和1 個對照。對照 (CK)，1/2 劑量Hoagland 和全劑量Arnon 營養液栽培；缺鐵 (-Fe)，不添加Fe-EDTA 的1/2 劑量Hoagland 和全劑量Arnon 營養液栽培，下同；缺錳 (-Mn)，不添加MnCl2，添加相同濃度的KCl；缺硼 (-B)，不添加H3BO3；缺鋅 (-Zn)，不添加ZnSO4；缺銅(-Cu)，不添加CuSO4。每組重復5 株。培養到1 個月左右的時候植株開始抽新梢，待新梢長勢穩定后每株植株保留2 個新梢，將新梢的葉片定義為新葉；處理6 個月后再保留一次抽梢，其葉定義為次級新葉。試驗持續10 個月。為了防止鹽分在基質中累積，每周用10 L 去離子水澆灌植株，而后用3 L營養液澆灌，確保有過量溶液從盆底淋出[18]。

1.2 測定方法

利用佳能 (Canon)EOS 6D (W) 數碼單反相機，對不同處理的紐荷爾臍橙癥狀葉片進行拍攝記錄。處理6 個月后，選取各處理有癥狀的紐荷爾臍橙老葉和新葉各6 片進行葉綠素含量的測定，具體參考Zhou 等[19]的方法進行。

采用美國LI-COR 公司生產的LI-6400XT 便攜式光合測定系統，于2017 年4 月22 日進行光合測定，當天晴朗無云，日出時間為5:50:37，日落時間為18:46:56，日照時長為12 小時56 分鐘16 秒。測量時間從7:00 到18:30，每1.5 或2 小時測定1 次。光合有效輻射 (PAR)、大氣溫度 (Tair)、田間二氧化碳濃度 (Ca)、相對濕度 (RH)、凈光合速率 (Pn)、蒸騰速率 (Tr)、胞間二氧化碳濃度 (Ci) 及氣孔導度 (Gs) 等參數由光合儀同步測定并記錄，所測定的葉片每株選取老葉6 片，新葉6 片，每個處理測定4 株，待LI-6400XT 系統穩定之后，每片葉讀取5 個瞬時各參數值，取平均值。

1.3 統計分析

除非特別說明，圖表中的數據代表4 株單獨植株 (重復) 的平均值。采用統計學軟件SPSS 22.0 對所得數據進行環境因子之間相關性分析，得到皮爾森相關系數，并進行顯著性檢驗。所有數據采用SAS軟件進行分析，運用ANOVA 和DONCAN 程序進行不同處理之間的差異顯著性分析 (SAS 8.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)，顯著水平為P ＜ 0.05。所有數據使用Sigmaplot 軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 紐荷爾臍橙不同微量元素缺乏的癥狀

以枳砧紐荷爾臍橙為材料進行不同微量元素缺乏處理，分別觀察其在處理6 個月和10 個月后的地上部癥狀。如圖1 所示，缺鐵 (-Fe)6 個月后紐荷爾臍橙初級新葉先顯癥狀，葉片呈黃綠色，葉脈保持綠色，呈細網狀葉脈；10 個月后次級新葉完全失綠呈白色或淡黃色，葉脈也呈白色。缺錳 (-Mn) 同樣在初級新葉先顯癥狀，葉淡綠呈細小網紋，脈間淺綠，在主脈和側脈間現不規則淺色條帶；10 個月時次級新葉呈黃色或灰白色，葉脈間現不透明褐色斑點，并停止生長。缺硼 (-B) 則是老葉先顯癥狀，處理6 個月時老葉不黃化，葉脈 (主脈和側脈) 輕微突起，觸摸感較強；10 個月后老葉葉脈嚴重爆裂同時伴有脈間輕微黃化，初級新葉葉片顯著增厚變硬，初級新梢莖尖新芽簇生，但均不能抽生次級新梢，植株停止生長。缺鋅 (-Zn) 處理6 個月時初級新葉先顯癥狀，呈現斑駁黃化；10 個月后次級新葉簇生、葉片嚴重變窄變小，有的葉片甚至出現畸形癥狀。缺銅 (-Cu) 紐荷爾臍橙6 個月后，初級新葉先顯輕微癥狀，葉色深綠，葉面凹凸不平；-Cu 處理10 個月后次級新葉葉脈彎曲成弓狀，葉色變淡，枝條細長而柔軟，扭曲下垂，頂端易枯死。

2.2 不同微量元素缺乏處理對紐荷爾臍橙葉片光合色素含量的影響

圖 1 缺素培養6 個月 (Ⅰ) 和10 個月 (Ⅱ) 后紐荷爾臍橙葉片微量元素缺乏癥狀Fig. 1 Symptoms of ‘Newhall’ navel orange leaves after 6 months (Ⅰ) and 10 months (Ⅱ) of nutrient deficient treatment

如圖1- (Ⅰ) 所示，不同微量元素缺乏6 個月后，紐荷爾臍橙老葉或初級新葉出現不同程度的失綠，光合色素含量測定結果表明:與對照 (CK) 相比，老葉中的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素及類胡蘿卜素的含量均無顯著差異 (圖2)。在初級新葉中，-Fe、-Mn 和-Zn 顯著降低了其葉綠素a 的含量，但-B、-Cu 無顯著影響；對于葉綠素b 和類胡蘿卜素的含量則只是在-Fe 的條件下顯著下降；總葉綠素含量則只在-Fe、-Mn 和-Zn 處理時顯著下降，且下降幅度為-Fe ＞ -Mn ＞ -Zn 處理；類胡蘿卜素的含量則在-Zn 處理時最高，-Fe 處理則顯著下降 (圖2)。

2.3 不同微量元素缺乏對紐荷爾臍橙葉片光合日變化的影響

2.3.1 環境因子日變化 由圖3 可知，光合有效輻射 (PAR) 日變化呈單峰曲線，9:00—15:00 PAR 值均在1000 μmol/(m2·s) 以上，13:00 時出現最高峰，達到1607 μmol/(m2·s)。大氣溫度 (Tair) 的變化趨勢與PAR 相似，也成單峰曲線，7:00 時最低，然后急劇上升，13:00 時達到最高溫度33.9℃，之后降低。Tair與前一時間點的PAR 之間r=0.892，相關性達到顯著 (P ＜ 0.05) 水平 (表1)。

7:00 時田間CO2濃度 (Ca) 出現最高值為447 μmol/mol，隨后不斷下降，在18:30 時略有回升。相對濕度 (RH)7:00 后急劇下降，13:00 達到最低值為29.8%，然后呈緩慢回升趨勢。Ca和RH 的變化趨勢均呈倒鐘型，二者相關性分析r=0.898，達到極顯著(P ＜ 0.01) 水平。Ca和RH 與Tair的相關性極顯著，r 值分別為-0.876 和-0.997(P ＜ 0.01)(表1)。

因此，在4 個與紐荷爾臍橙光合作用相關的環境因子中，PAR 為驅動因子，在其他因子的變化中起主導作用 (表1)。

2.3.2 凈光合速率 (Pn) 日變化 圖4 結果顯示，在紐荷爾臍橙CK 的新葉和老葉中，Pn日變化的趨勢均為單峰曲線，峰值出現在9:00 時，為10.6 和8.7 μmol/(m2·s)。微量元素缺乏處理后，-B 處理顯著改變了老葉的Pn日變化的趨勢，另外推遲了-Zn 處理峰值出現的時間。在新葉的峰值 (9:00) 時，-Fe、-Mn 和-Zn 處理顯著降低了Pn的峰值，雖然此時對-B 和-Cu 處理的Pn無顯著影響，但在11:00 時有顯著下降。在老葉的峰值 (9:00) 時，-B 處理顯著降低了Pn的峰值。

圖 2 紐荷爾臍橙缺乏不同微量元素新、老葉片葉綠素及類胡蘿卜素含量Fig. 2 Chlorophylls and carotenoid contents in the new leaves and old leaves of ‘Newhall’ navel orange with micronutrients deficiencies

圖 3 光合有效輻射、大氣溫度、田間二氧化碳濃度和相對濕度日變化Fig. 3 Diurnal variation of photosynthetic active radiation (PAR), air temperature (Tair), field CO2 concentration (Ca)and relative humidity (RH)

Pn日均值結果顯示，與CK 相比，-Fe、-Mn 和-Zn 處理顯著降低了新葉的Pn日均值，降幅達60.0%、24.5%和28.9%，但對-B 和-Cu 處理新葉無顯著影響。在老葉中，則是-Fe 和-B 處理顯著降低了其Pn日均值，降幅分別為19.9%和85.9%，-B 處理紐荷爾臍橙老葉凈光合速率已經接近停止 (表2)。

表 1 環境因子之間相關分析Table 1 Correlation analysis among environmental factors

圖 4 紐荷爾臍橙缺乏不同微量元素新、老葉片凈光合速率 (Pn) 日變化Fig. 4 Diurnal variation of net photosynthetic rate (Pn) in old leaves and new leaves of ‘Newhall’ navel orange with micronutrients deficiency

表 2 紐荷爾臍橙缺乏不同微量元素新、老葉片光合特性日均值比較Table 2 Comparison of photosynthetic traits in new leaves and old leaves of ‘Newhall’ navel orange with micronutrients deficiency

圖 5 紐荷爾臍橙缺乏不同微量元素新、老葉片蒸騰速率 (Tr) 日變化Fig. 5 Diurnal variation of transpiration rate (Tr) in old leaves and new leaves of ‘Newhall’ navel orange with micronutrients deficiency

圖 6 紐荷爾臍橙缺乏不同微量元素新、老葉片胞間CO2 濃度 (Ci ) 日變化Fig. 6 Diurnal variation of intercellular CO2 concentration (Ci ) in old leaves and new leaves of ‘Newhall’ navel orange with micronutrients deficiency

2.3.3 蒸騰速率 (Tr) 日變化 如圖5 所示，CK 及微量元素缺乏處理的紐荷爾臍橙的新葉Tr日變化的趨勢均為雙峰曲線，除-Fe 處理首峰出現在11:00時，其他首峰均出現在9:00 時，次峰出現在15:00；老葉中除-B 外均為單峰曲線，但從9:00 至13:00時變化較平緩。在新葉的首峰 (9:00) 時，Tr值在-Fe 和-Zn 條件下被顯著抑制，CK 9:00 至11:00 時變化平緩，但除-B 處理外，其他處理均在11:00 時顯著下降。-B 處理的老葉Tr值從測定開始到結束始終維持在較低水平，且顯著低于對照。其他處理的老葉Tr值則與對照無顯著差異。

如表2 所示，Tr日均值僅在-Fe 處理的新葉和-B 處理的老葉中顯著下降，降幅分別為24.6%和41.6%，其他處理新葉和老葉與CK 相比均無顯著差異。

2.3.4 胞間二氧化碳濃度 (Ci) 日變化 從圖6 可知，與田間CO2濃度變化趨勢相似 (圖3)，除-B 處理的老葉外，所有對照與處理的Ci日變化趨勢均呈現先下降后升高的趨勢，并達到峰值。Ci值受影響最顯著的分別是-Fe 處理的新葉和-B 處理的老葉，其他處理與對照比較差異不顯著。

紐荷爾臍橙Ci日均值僅在-Fe 處理的新葉和-B 處理的老葉中與CK 相比顯著升高，升幅為18.7%和35.3%，其他處理均無顯著差異。

圖 7 紐荷爾臍橙缺乏不同微量元素新、老葉片氣孔導度 (Gs ) 日變化Fig. 7 Diurnal variation of stomatal conductance (Gs ) in old leaves and new leaves of ‘Newhall’ navel orange with micronutrients deficiency

2.3.5 氣孔導度 (Gs) 日變化 圖7 結果顯示，Gs日變化在CK 的新葉中呈雙峰曲線，老葉中則為單峰曲線，首峰均出現在9:00 時，分別為148 和126 mmol/(m2·s)，新葉次峰出現在15:00 時，為69 mmol/(m2·s)，且次峰值低于首峰值。微量元素缺乏處理后，新葉中僅有-Zn 處理次峰消失，-Mn 和-B 處理的老葉中則在15:00 時出現了次峰。在新葉的首峰 (9:00) 時，除-B 和-Cu 處理外其他處理的Gs值均顯著低于對照，而在次峰 (15:00) 時，只有-Fe、-B 和-Zn 處理的Gs值顯著低于對照。在老葉的首峰 (9:00) 時，只有-B 處理的Gs值顯著低于對照。

新葉中Gs日均值在-Fe 和-Zn 處理時與對照相比顯著下降，下降幅度為29.9%和21.7%；在老葉中-Fe 和-Zn 處理表現為顯著上升，但在-B 處理時表現為顯著下降，下降幅度達59.6%(表2)。

3 討論

3.1 柑橘微量元素缺乏的癥狀

柑橘微量元素缺乏通常發生在新開墾或高地下水位或高度沙化或鈣化的柑橘園[6-7]。Fe 作為葉綠素合成中酶或輔酶的活化劑直接參與葉綠素的形成，因此-Fe 最典型的癥狀就是新葉的退綠[20]。本研究的結果表明，-Fe 處理6 個月后紐荷爾臍橙初級新葉先顯癥狀，葉片呈黃綠色，葉脈保持綠色，呈細網狀葉脈；10 個月后次級新葉完全失綠呈白色或淡黃色，葉脈也呈白色 (圖1)。這與前人在枳、香橙、紅桔等柑橘類果樹中的報道相似[8,21]，但本研究的結果能清晰明確地看到不同級別新葉的缺Fe 癥狀及差異(圖1)。Mn 雖然不直接參與葉綠素的合成，但是對維護葉綠體膜結構起著至關重要的作用[22]，因此缺Mn 柑橘葉片會在幼葉出現脈間失綠的癥狀，但在田間通常出現癥狀較晚且容易被缺Fe 或缺Zn 的癥狀所掩蓋[7]。本研究通過砂培盆栽試驗，明確地觀察到了這一癥狀，且進一步獲得缺Mn 嚴重時的癥狀，即次級新葉呈黃色或灰白色，葉脈間現不透明褐色斑點 (圖1)。

關于柑橘缺B 的研究較多且典型癥狀穩定，主要表現為葉脈的爆裂和生長點的壞死 (植株低矮)[19,21]，但本研究除觀察到上述癥狀外，還獲得了初級新葉葉片顯著增厚變硬、初級新梢莖尖新芽簇生但均不能抽生次級新梢的癥狀 (圖1)，類似癥狀在其他植物中也有報道，但在柑橘中則鮮有報道。Zn 是植物體內許多酶的組成成分和活化劑，并能有效的促進光合作用。柑橘缺Zn 在田間通常表現為斑駁失綠(mottle-leaf)[7]。柑橘缺Zn 的典型癥狀是除斑駁黃化外，還有葉小而簇生呈蓮叢狀 (rosette)、節間縮短、植株矮小；如有結果則果實小而畸形，果皮厚，果肉木質化[22-23]。本研究在紐荷爾臍橙-Zn 處理6 個月時初級新葉便呈現典型的斑駁黃化，在10 個月后，則觀察到新葉簇生、葉片嚴重變窄變小，有的葉片甚至出現畸形癥狀 (圖1)。柑橘缺Cu 初期癥狀表現為葉片大、深綠色，有的葉形不規則，主脈彎曲，腋芽易枯死[24-25]。本研究發現紐荷爾臍橙缺Cu 6 個月后，初級新葉先顯輕微癥狀，葉色深綠，葉面凹凸不平；缺Cu 10 個月后次級新葉葉脈彎曲成弓狀，葉色變淡，枝條細長而柔軟，扭曲下垂，頂端易枯死 (圖1)，這與前人的研究基本一致。

3.2 柑橘微量元素缺乏與光合特性的關系

微量元素缺乏影響柑橘葉綠素合成的同時對葉片光合作用也有顯著影響。柑橘為C4植物，因此通常情況下柑橘的Pn日變化呈雙峰曲線，但受品種、砧木和外界環境條件的影響。如琯溪蜜柚凈光合速率 (Pn) 的日變化的首峰出現在上午的8:00—10:00時，次峰出現在14:00 時以后，而在溫州蜜柑中首峰出現在上午10:00 時，次峰出現在13:00 時以后[26-27]，且陰天時次峰會消失。作為紐荷爾臍橙優良芽變的桂臍一號，在嫁接不同砧木時其Pn日變化呈現為單峰、雙峰甚至多峰現象[28]。本研究結果表明Pn日變化在對照的新葉和老葉中均呈單峰曲線，峰值出現在上午9:00 時，但是微量元素缺乏處理后，如-B 處理顯著改變了老葉的Pn日變化趨勢，另外-Zn 處理推遲了峰值出現的時間(圖4)。徐春麗等[29]通過砂培進行缺Zn 試驗，同樣表明在缺Zn 脅迫條件下“不知火”葉片的凈光合速率 (Pn) 日變化呈單峰曲線，對照則為雙峰曲線。因此，微量元素缺乏可以改變柑橘的Pn日變化的趨勢。

許多研究表明微量元素能夠直接或間接影響植物的光合特性[30]。凌麗俐等[31]研究表明，早期的缺Zn 和潛在的缺Zn(低Zn) 會明顯降低柑橘的光合效率。另外徐春麗等[29]報道缺Zn 降低了柑橘葉片葉綠素、Pn、Tr和Gs。本試驗結果同樣表明，紐荷爾臍橙幼苗在缺Zn 條件下其葉片凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度在新葉中受到顯著抑制 (圖4～圖7，表2)。雖然B 不直接參與植物的光合作用，但是在缺B 條件下甜橙會在葉片中積累大量非結構物質的CO2，從而反饋抑制葉片的光合作用[32]。

4 結論

紐荷爾臍橙微量元素缺乏前期和后期的癥狀有較大差異。缺Fe 前期初級新葉呈黃綠色，后期次級新葉完全失綠呈白色或淡黃色，葉脈也呈白色；缺Mn前期初級新葉脈間現不規則淺色條帶，后期次級新葉呈黃色或灰白色，葉脈間現不透明褐色斑點；缺B 前期老葉葉脈輕微突起，后期老葉葉脈嚴重爆裂同時伴有脈間輕微黃化，初級新葉顯著增厚變硬，初級新梢莖尖新芽簇生；缺Zn 前期初級新葉斑駁黃化，后期次級新葉簇生、葉片嚴重變窄變小；缺Cu 前期初級新葉葉面凹凸不平，后期次級新葉葉脈彎曲成弓狀，葉色變淡，枝條細長而柔軟，扭曲下垂，頂端易枯死。葉片光合特性研究表明，-Fe、-Mn 和-Zn 處理的新葉和-B 處理的老葉有顯著的峰值和變化趨勢特征，而-Cu 處理的無顯著特征。