熱脅迫下水仙花葉片的轉(zhuǎn)錄組分析

宋姣敏 徐小萍 陳裕坤 陳桂信 賴鐘雄

摘 ?要??為研究水仙響應(yīng)高溫脅迫過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)及響應(yīng)熱應(yīng)激的分子機(jī)制，本研究以漳州水仙花為材料，使用BGISEQ-500測(cè)序技術(shù)，對(duì)高溫（30、35?℃）處理及正常生長(zhǎng)條件（15?℃）的水仙葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)的測(cè)序分析。使用Trinity軟件對(duì)15（對(duì)照）、30、35?℃（高溫脅迫）處理24 h的水仙葉片測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝，利用BLAST軟件進(jìn)行基因比對(duì)注釋，通過(guò)DEGseq和PossionDis檢測(cè)差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。結(jié)果表明：本次水仙花葉片測(cè)序共獲得112 160條總長(zhǎng)度為128 733 815 bp、平均長(zhǎng)度為1147 bp的Unigene，其N50以及GC含量分別為1770?bp和42.33%。Nr比對(duì)注釋匹配度最高的物種為石刁柏，利用KOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，5560條Unigene序列分布于25個(gè)功能區(qū)域。差異表達(dá)基因GO富集顯示與光合系統(tǒng)及膜系統(tǒng)相關(guān)的GO term被顯著富集，KEGG分析顯示次生代謝物的生物合成、苯丙烷類生物合成、代謝途徑、光合作用、糖胺聚糖降解、乙醛酸和二羧酸代謝、光合作用-天線蛋白、單萜類生物合成等8條代謝途徑在3個(gè)比較組中均顯著性富集，硫胺素代謝途徑是唯一在高溫脅迫條件下均顯著富集的代謝途徑。本研究注釋了大量相關(guān)基因序列，通過(guò)本研究為改善水仙花植物的耐熱性及耐熱性品種的培育提供了豐富的數(shù)據(jù)資源和分子基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ?水仙;高溫脅迫;轉(zhuǎn)錄組;差異表達(dá)基因中圖分類號(hào)??S682.2+1??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Analyses of Leaf Transcriptome under Heat Stress in Narcissus

SONG Jiaomin， XU Xiaoping， CHEN Yukun， CHEN Guixin^*， LAI Zhongxiong^*

College of Horticluture / Horticultural Plant Bioengineering Institute， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract ?To explore the pathways of response to heat stress and mechanism of heat-tolerance ofNarcissus tazetta var.?chinensis，?we used the BGISEQ-500 sequencing technology andde novotranscriptome assembly to gain a comprehensive overview of the transcriptome?of the leaves under heat temperature?（30?℃， 35?℃） and normal growth conditions （15?℃）. The data of?RNA-Seq treated 24 h at 15， 30， 35?℃?werede novoassembled using Trinity software.?Gene annotation was performed using BLAST software， and differentially expressed genes were detected by DEGseq and PossionDis. A total of 112 160 unigenes were generated with a toal length of 128 733 815 bp， average length of 1147 bp and N50 of 1770 bp. For annotation functional，Narcissuswas highly similar to Asparagus officinalis species. On the basis of clusters of euKaryotic Orithologous Groups?（KOG） analysis， 5560 unigene sequences were distributed over 25 functional regions. Gene Ontology （GO） enrichment of DEGs showed significant enrichment of GO term associated with photosynthetic systems and membrane systems. KEGG analysis showed?significant enrichment of the pathways?about the biosynthesis of secondary metabolites， phenylpropanoid biosynthesis， metabolic pathways， photosynthesis， glycosaminoglycan degradation， glyoxylic acid and dicarboxylic acid metabolism， photosynthesis-antenna proteins， monoterpenoid biosynthesis， etc. And the thiamine metabolc pathway was the only one that was significantly enriched under high temperature stress conditions. The study annotated a large number of related gene sequences， and would provide abundant data resources and molecular basis for improving the heat tolerance and heat tolerance ofNarcissus.

Keywords ?Narcissus; high temperature stress; transcriptome; differentially expressed gene

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.011

中國(guó)水仙別名雅蒜、天蔥、麗蘭等，是中國(guó)的十大傳統(tǒng)名花之一，也是漳州市的市花，屬石蒜科（Amaryllidaceae）水仙屬（Narcissus）植物。不僅具有極高的觀賞價(jià)值，還具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值^[1]。中國(guó)水仙的生長(zhǎng)發(fā)育期需要涼爽的氣候，尤其是生長(zhǎng)前期溫度以12～20?℃為宜，生長(zhǎng)后期以20～24?℃為宜，可耐0～2?℃的低溫^[2]，主要用于春節(jié)前后水養(yǎng)觀賞，是較受歡迎的春節(jié)花卉之一。

然而，水仙栽培存在切花上市時(shí)間遲、花期集中、供花期短等問(wèn)題。因此，調(diào)節(jié)花期、延長(zhǎng)上市時(shí)間是生產(chǎn)上迫切需要解決的問(wèn)題。暖冬現(xiàn)象帶來(lái)的氣溫普遍較高影響了花球的質(zhì)量^[3]。研究顯示，溫度越高，水仙花的開(kāi)花周期（指從種球開(kāi)始栽培到開(kāi)花所需要的時(shí)間）越短，水仙花的盛開(kāi)時(shí)間越短^[4]。隨著全球氣候日益變暖，氣溫逐漸升高的氣候變化特點(diǎn)日益突出^[5]，探究水仙在溫度脅迫中的應(yīng)對(duì)機(jī)制，篩選水仙熱脅迫基因，提高水仙的抗高溫能力以培育具有耐熱性的品種是減輕溫度升高對(duì)水仙生長(zhǎng)與觀賞價(jià)值產(chǎn)生嚴(yán)重影響的有效方法。

目前關(guān)于溫度對(duì)水仙生命活動(dòng)的影響主要集中在溫度與水仙種球休眠的關(guān)系研究^[6-9]，尚未有與休眠相關(guān)的基因克隆^[10]和耐熱性相關(guān)的研究。葉片作為植物最基本最主要的活動(dòng)場(chǎng)所，是植物對(duì)不同環(huán)境反應(yīng)最敏感的器官，因此本研究以水仙花的葉片為測(cè)序材料，構(gòu)建不同溫度處理下的水仙花葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，為探究水仙響應(yīng)高溫脅迫過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)及響應(yīng)熱應(yīng)激的分子機(jī)制，篩選與水仙耐熱相關(guān)的基因，改善水仙花植物的耐熱性及耐熱品種的培育提供了豐富的數(shù)據(jù)資源和分子基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1材料

本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)分析以金盞銀臺(tái)為研究對(duì)象，購(gòu)置3年生的商品球，大小為一級(jí)（周長(zhǎng)22～23?cm）。

選取健壯的水仙鱗莖球，剝?nèi)[莖球外層干枯鱗片，上盆后置于溫室內(nèi)培養(yǎng)（光照時(shí)間12?h，溫度16?℃），待水仙長(zhǎng)至約株高20?cm時(shí)挑選生長(zhǎng)一致的植株，轉(zhuǎn)移至不同溫度（15、30、35?℃）的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h;分別采集不同溫度下培養(yǎng)的水仙葉片，在液氮中速凍，置于?80?℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ?5?℃處理做對(duì)照，30、35?℃?2個(gè)高溫脅迫處理，每個(gè)處理溫度設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2方法

1.2.1??水仙葉片RNA提取??采用離心柱型多糖多酚RNA提取試劑盒（Bio Teke Corporation）提取水仙葉片的總RNA后，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，結(jié)合瓊脂糖凝膠雙向電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量，所提取的總RNA置于超低溫冰箱（?80?℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?水仙葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的cDNA文庫(kù)構(gòu)建??總RNA經(jīng)過(guò)Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)量檢測(cè)后，委托深圳華大基因公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

1.3.1??測(cè)序質(zhì)量分析 ?在原始數(shù)據(jù)Raw reads中去除掉包含接頭adaptor reads、低質(zhì)量reads及N>5%的reads基礎(chǔ)上，獲得clean reads用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析，并儲(chǔ)存于格式為fastq的數(shù)據(jù)文件中。

1.3.2??數(shù)據(jù)組裝??由于水仙花目前還沒(méi)有相應(yīng)的參考基因組序列，故采用de novo組裝的方式，通過(guò)Trinity軟件對(duì)去除PCR重復(fù)的clean reads進(jìn)行組裝，然后使用Tgicl軟件進(jìn)行聚類去冗余得到Unigene，對(duì)每個(gè)樣品的Unigene再次使用Tgicl進(jìn)行聚類去冗余得到最終的Unigene用于后續(xù)分析，詳細(xì)步驟參見(jiàn)宋志丹^[11]對(duì)沙冬青的研究。

1.3.3??轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息注釋 ?對(duì)最終獲得的Unigene序列進(jìn)行基因功能注釋和表達(dá)量信息注釋。將Unigene序列與Blast數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得Unigene的注釋信息，通過(guò)與Blastn^[12]數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得Unigene的Nt注釋，得到相關(guān)的核酸信息，通過(guò)與Blastx^[12]或Diamond^[13]比對(duì)獲得Unigene的Nr、KOG、KEGG以及SwissProt信息，得到最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息;通過(guò)與Blast2GO^[14]以及Nr注釋結(jié)果進(jìn)行GO注釋，使用InterProScan5^[15]進(jìn)行InterPro比對(duì)。通過(guò)與各數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，獲得相關(guān)性最高的Unigenes注釋信息。

1.3.4 ?基因表達(dá)量及差異表達(dá)基因分析??我們使用Bowite2將clean reads比對(duì)到Unigene，然后使用RSEM（進(jìn)行表達(dá)量水平估計(jì)）計(jì)算各樣品的基因表達(dá)量，利用FPKM值表示對(duì)應(yīng)的Unigene表達(dá)豐度，計(jì)算公式：

式中，cDNA Fragments：比對(duì)到某一轉(zhuǎn)錄本的片段數(shù)目;Mapped fragments （Millions）：表示比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本上的片段總數(shù);Transcript length （kb）：轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度（kb）。

根據(jù)差異基因的表達(dá)量（FPKM）利用DEGseq方法計(jì)算每個(gè)Unigene代表的基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。以|log₂Fold change|≥1，且q-value≤0.001為閥值，篩選出水仙在不同溫度24?h脅迫下的樣品兩兩比較（T15_vs_T30、T15_vs_T35、T30_vs_T35）的全部差異基因。對(duì)差異表達(dá)基因的pathway進(jìn)行富集分析，篩選出富集到并且與本研究相關(guān)的信號(hào)通路。并通過(guò)GO功能分析確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能。

2??結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果與質(zhì)量評(píng)估

各樣品的過(guò)濾結(jié)果見(jiàn)表1，數(shù)據(jù)過(guò)濾后的reads占總reads數(shù)的比例在97.25%～98.04%之間，各樣品的Q20均在97%。以上結(jié)果說(shuō)明測(cè)序結(jié)果良好，可用于后續(xù)分析。PCA分析顯示每個(gè)處理間的重復(fù)性較好（圖2）。

將各樣品過(guò)濾后的reads進(jìn)行de novo組裝及聚類去冗余，共得到112?160個(gè)葉片Unigene，總長(zhǎng)度、平均長(zhǎng)度、N50以及GC含量分別為128?733?815?bp、1147?bp、1770?bp和42.33%。長(zhǎng)度分布見(jiàn)圖3，分布在300～500?nt和600～1000?nt，數(shù)量分別達(dá)到了38 428條（34.26%）和24 424條（21.78%），長(zhǎng)度≥3000?nt的序列僅有6255條占8.40%。水仙葉片的Unigene以小片段為主，本次測(cè)序的Uningene組裝結(jié)果可信度較高，準(zhǔn)確性較好，可供后續(xù)研究。

2.2Unigene的功能注釋

將All_Unigene序列（112?160條）直接比對(duì)到Nt、Nr、KOG、Swissprot、KEGG、Interpro和GO七大數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋（E-value<1.0e-5），結(jié)果如表2所示。被七大數(shù)據(jù)庫(kù)任意一個(gè)比對(duì)注釋上的Unigene序列有75?873條，占比67.65%;被所有數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后皆能被注釋上的Unigene序列有8889條，其比例僅有7.93%。

比對(duì)到Nr和SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)的序列分別為72 647條（占Unigene總數(shù)的64.77%）、53?132條（占Unigene總數(shù)的47.37%）。

2.2.1 ?Unigene的Nr分析??從Nr注釋基因匹配的物種分布情況來(lái)看，與石刁柏（Asparagus officinalis）物種類似的Unigene序列占比最大，高達(dá)60.58%，其次為油棕（Elaeis guineensis）、海棗（Phoenix dactylifera）、香蕉（Musa acuminatasubsp.malaccensis）、菠蘿（Ananas comosus）等物種見(jiàn)圖4。

2.2.2 ?Unigene的KOG分析??利用KOG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)組裝得到的112?160條Unigene序列進(jìn)行KOG直系同源分類（圖5）。共有56?660條（50.52%）Unigene序列被成功注釋并進(jìn)行功能分類統(tǒng)計(jì)后分配到25個(gè)KOG類別。在25個(gè)KOG類別中，僅“一般功能預(yù)測(cè)（General function prediction only）”的群集代表最大的群體，有14?489條，其次是“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（Signal transduction mechanisms，6789條）”、“翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶（Posttranslational modification，?protein turnover， chaperones， 6436條）”和“轉(zhuǎn)錄（Transcription， 5135條）”，涉及“碳水化合物的運(yùn)輸和新陳代謝（Carbohydrate transport and metabolism， 3314條）”、“RNA加工和修飾（RNA processing and modification， 3269條）”及“細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，分泌和囊泡運(yùn)輸（Intracellular trafficking，?secretion，?and vesicular transport）”的功能基因也比較豐富，只有一小部分Unigenes被指定為“核結(jié)構(gòu)（Nuclear structure， 357條）”、“細(xì)胞外結(jié)構(gòu)（Extracellular structures， 212條）”或“細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（Cell motility， 55條）”。此外有5359條Unigene序列的屬于功能未知（Function unknown）集群。以上結(jié)果說(shuō)明：水仙的熱應(yīng)激反應(yīng)引起了“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”等眾多基因的表達(dá)，推測(cè)這些基因在水仙熱應(yīng)激反應(yīng)中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用;此外，水仙響應(yīng)高溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組中包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)等相關(guān)的眾多基因，表明水仙對(duì)熱脅迫的應(yīng)激反應(yīng)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，有大量的調(diào)節(jié)因子參與其中。

2.3基因表達(dá)水平分析

參照Audic和Claverie（1997）的FPKM方法計(jì)算測(cè)序后組裝得到Unigene的表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖6。在各樣品中，轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度集中在FPKM值≤1、110這2個(gè)區(qū)域，而FPKM值≥10的基因數(shù)量?jī)H占很小一部分。按FPKM值的大小排序獲得3個(gè)文庫(kù)中基因表達(dá)水平最高的前20條序列，并進(jìn)行Venny圖分析（圖6C）。T30、T35文庫(kù)特有的3、4條序列可能特異響應(yīng)水仙花30、35?℃高溫脅迫，值得深入研究，例如35?℃處理文庫(kù)中獨(dú)有的4條序列中有2條ID號(hào)為CL57.Contig4_All、CL57.Contig9_All的基因?qū)儆趕HSP18.4 ku。

以|log₂Fold change|≥1，且q-value≤0.001為閥值，篩選DEG，對(duì)3個(gè)比較組中|log₂Fold change|值最大的前20條序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（15?℃溫度處理）相比，2個(gè)高溫處理組中差異表達(dá)倍數(shù)較大的前20條序列中，都含有HSP基因，且都表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，尤其是在T15_vs_T35組合中，上調(diào)表達(dá)的HSP基因高達(dá)9條，占45%，且全是sHSPs（Small heat shock protein），主要涉及HSP18.1及HSP17.4兩類。且有2個(gè)sHSPs基因在正常溫度條件下表達(dá)量很低或者不表達(dá)，而在受到24?h的高溫脅迫后最高表達(dá)，說(shuō)明水仙花的HSP18.1、HSP17.4基因不僅在響應(yīng)高溫脅迫中高度表達(dá)，也存在于正常生長(zhǎng)的細(xì)胞中。Changle等^[16]在對(duì)擬南芥中2個(gè)過(guò)氧化物酶體sHSPs表達(dá)的研究中認(rèn)為擬南芥AtHSP15.7基因在正常條件下幾乎檢測(cè)不到，但在熱脅迫30 min后迅速表達(dá)，并證明了AtHsp15.7特異性地由植物過(guò)氧化物酶體基質(zhì)蛋白中的熱應(yīng)激誘導(dǎo)。因此，在水仙熱脅迫中HSP家族發(fā)揮重要的作用，尤其是sHSPs，目前關(guān)于HSP18.1、HSP17.4基因在水仙植物中是如何參與熱應(yīng)激的未見(jiàn)報(bào)道。

A： RNA processing and modification;?B： Chromatin structure and dynamics;?C Energy production and conversion;?DCell cycle control， cell division， chromosome partitioning;?E： Amino acid transport and metabolism;?F： Nucleotide transport and metabolism; G： Carbohydrate transport and metabolism;?H： Coenzyme transport and metabolism;?I： Lipid transport and metabolism;?J： Translation， ribosomal structure and biogenesis;?K： Transcription; L： Replication， recombination and repair;?M： Cell wall/membrane/envelope biogenesis;?N： Cell motility;?O： Posttranslational modification， protein turnover， chaperones;?P： Inorganic ion transport and metabolism;?Q： Secondary metabolites biosynthesis， transport and catabolism; R： General function prediction only;?S： Function unknown;?T： Signal transduction mechanisms;?U： Intracellular trafficking， secretion， and vesicular transport;?V： Defense mechanisms;?W： Extracellular structures; Y： Nuclear structure; Z： Cytoskeleton.

A：基因表達(dá)量分布;B：基因表達(dá)量密度;C：FPKM值最大的前20個(gè)序列的venny。

A： distribution of gene expression;?B： density of gene expression; C： venny of the top 20 sequences with the largest FPKM

2.4水仙響應(yīng)高溫脅迫差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析

2.4.1 顯著差異表達(dá)基因的GO功能富集??圖7顯示了差異表達(dá)基因在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中顯著富集的GO term（P-value<0.001）。在細(xì)胞組分方面，T15_vs_T30和T15_vs_T35兩個(gè)組合之間，GO富集程度較顯著的GO term均有15條，且二者顯著富集的GO term種類term種類也相同，都包含了光合膜、光系統(tǒng)、類囊體膜、類囊體、葉綠體、質(zhì)體等與光合作用密切相關(guān)的GO term;而在T30_vs_T35組合中，除光系統(tǒng)Ⅱ及光系統(tǒng)得到最顯著富集外，還有細(xì)胞外區(qū)域、光系統(tǒng)Ⅱ氧氣進(jìn)化復(fù)合物、膜的外部組分、膜、氧化還原酶復(fù)合物也得到了顯著富集。在生物過(guò)程方面，3個(gè)比較組中顯著富集程度最高的均是光合作用，此外在T15_vs_T30組合中細(xì)胞碳水化合物代謝過(guò)程、碳水化合物代謝過(guò)程、多糖代謝過(guò)程也得到了顯著富集;在T15_vs_T35組合中葉綠素生物合成、含卟啉的化合物生物合成過(guò)程和小分子分解代謝過(guò)程被顯著富集;在T30_vs_T35組合中細(xì)胞壁組織或生物發(fā)生和細(xì)胞壁組織被顯著富集。說(shuō)明高溫脅迫影響水仙的光合作用、碳代謝及能量代謝，且35?℃高溫脅迫時(shí)植物的細(xì)胞已經(jīng)被破壞。在分子功能方面，3個(gè)組合中差異基因數(shù)量都是最多的，且T15_vs_T30及T15_vs_T35兩個(gè)組合都在葉綠素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、輔因子結(jié)合得到顯著富集，而T30_vs_T35與前2個(gè)組合的差異表達(dá)基因的顯著富集差異較大，除四吡咯結(jié)合外還包括作用于成對(duì)供體的氧化還原酶活性與一對(duì)供體的氧化導(dǎo)致一分子氧還原兩分子水、O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性、酶抑制劑活性等。上述結(jié)果說(shuō)明，在高溫脅迫下，水仙植物的光合作用及呼吸作用被抑制，35?℃高溫處理下植物體內(nèi)的活性氧增加，并且這些差異表達(dá)的基因在響應(yīng)熱脅迫時(shí)存在表達(dá)差異。

2.4.2 ?差異表達(dá)基因的KEGG富集分析??水仙葉片高溫處理下的差異表達(dá)基因可富集到135條pathway中，其中T15_vs_T30組合有8015個(gè)基因、T15_vs_T35組合有14?618個(gè)基因、T30_vs_T35組合有5105個(gè)基因。定義q-value≤?0.05的pathway作為差異表達(dá)基因顯著性富集的pathway，T15_vs_T30、T15_vs_T35、T30_vs_T35三個(gè)組合中分別有23、39及32條Pathway被顯著性富集。

對(duì)差異表達(dá)基因前20條KEGG富集途徑，按富集因子進(jìn)行散點(diǎn)圖繪制（圖8）。在T15_vs_T30組合中，蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工處理途徑是富集程度最高的，其次是精氨酸代謝途徑，在T15_vs_T35組合中富集程度最高的是苯丙烷類的生物合成;花生四烯酸代謝、鞘糖生物合成-神經(jīng)節(jié)系列在T30_vs_T35組合中也得到了較高富集。此外，僅硫胺素代謝途徑在T15_vs_T30及T15_vs_T35組合中均富集到前20;化合物的生物合成、氨基酸的生物合成、光合生物中的碳固定僅在T15_vs_T35組合中富集到了前20;同時(shí)，次生代謝物的生物合成、苯丙烷類生物合成、糖胺聚糖降解、代謝途徑、光合作用、單萜類生物合成、光合作用-天線蛋白質(zhì)、乙醛酸和二羧酸代謝等途徑在3個(gè)比較組中均被富集到了前20。這些結(jié)果說(shuō)明：次生代謝物的生物合成、苯丙烷類生物合成、糖胺聚糖降解、代謝途徑、光合作用、單萜類生物合成、光合作用-天線蛋白質(zhì)、乙醛酸和二羧酸代謝等途徑在水仙響應(yīng)高溫脅迫過(guò)程中起關(guān)鍵作用，能量轉(zhuǎn)換及苯丙烷類、萜類化合物很可能參與緩解高溫脅迫;表明硫胺素代謝對(duì)響應(yīng)30、35?℃高溫可能起著重要作用;35?℃的高溫對(duì)水仙的光合作用，碳代謝、萜類化合物及氨基酸的生物合成影響顯著。

縱坐標(biāo)為GO條目，橫坐標(biāo)為GO條目的基因富集數(shù)，只顯示了GO三大本體中P<0.001的GO條目。

Y-axis is the GO term， X-axis is the number of GO term gene enrichment， which shows part ofontology GO that the GO term ofP<0.001.

3??討論

溫度是植物正常生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺的外界條件之一，當(dāng)外界條件高于植物生長(zhǎng)適宜溫度時(shí)，便會(huì)影響植物的正常生命活動(dòng)，像光合作用、呼吸作用、激素以及其他次級(jí)代謝物的產(chǎn)生等，使植物生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成植物死亡。本研究以不同程度高溫脅迫的水仙葉片建庫(kù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得112?160條總長(zhǎng)度為128?733?815?bp的Unigene序列。在112?160個(gè)Unigene序列中，有75?873個(gè)（約67.65%）Unigene序列成功注釋，這為改善水仙花植物的耐熱性及耐熱品種的培育提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析顯示，在高溫脅迫下顯著差異表達(dá)的基因共有25?852條，其中包括|log₂Fold change|≥2，且q-value≤0.001的極顯著差異基因10?568條，說(shuō)明有很多基因參與了水仙的高溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)。且相對(duì)表達(dá)量最高的前20條基因均注釋為HSP基因，這說(shuō)明在水仙的熱脅迫過(guò)程中HSP基因發(fā)揮著重要的作用。HSPs的產(chǎn)生可保護(hù)機(jī)體蛋白質(zhì)免遭損傷，或通過(guò)修復(fù)已受損傷的蛋白質(zhì)，以維持許多細(xì)胞蛋白在非正常環(huán)境條件下行使正常的功能^[17]。

對(duì)Unigene序列進(jìn)行功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，在熱脅迫條件下，與結(jié)合、催化活性等相關(guān)的基因較為活躍，差異表達(dá)基因的GO功能富集分析顯示，30、35?℃的高溫脅迫使水仙細(xì)胞的細(xì)胞膜系統(tǒng)遭到破壞，與15?℃對(duì)照相比，30、35?℃高溫處理下與光合膜、類囊體膜相關(guān)的GO term都得到了顯著富集，此外與光系統(tǒng)、類囊體、葉綠體、質(zhì)體相關(guān)的GO term也得到了富集，說(shuō)明葉綠體的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了改變，致使依賴于葉綠體的生命活動(dòng)受阻，如光合作用^[18-19]。有研究顯示高溫脅迫對(duì)植物細(xì)胞最大傷害的是葉綠體類囊體膜上的碳代謝基質(zhì)和光化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)^[20-21]，而光合作用及呼吸作用的變化會(huì)引起氧化脅迫及有害活性氧（ROS）物質(zhì)積累^[22-24]。本研究中，與光合作用途徑中的光反應(yīng)及碳水化合物的代謝過(guò)程被顯著富集。此外，多糖代謝、氧化還原復(fù)合物、輔因子結(jié)合等也得到了顯著富集，同時(shí)，谷胱甘肽代謝途徑在T15_vs_T35組合中被顯著富集。推測(cè)水仙花在受到高溫脅迫時(shí)，光合作用被抑制，谷胱甘肽作為非酶促反應(yīng)活性氧清除機(jī)制在水仙的熱脅迫中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。此外花生四烯酸代謝、鞘糖生物合成-神經(jīng)節(jié)系列、苯丙烷類的生物合成、糖胺聚糖降解途徑也可能參與了水仙的熱脅迫反應(yīng)。

硫胺素代謝途徑在15?℃（T15_vs_T30、T15_vs_T35）相關(guān)的組合中富集程度都比較高，在高溫下與硫胺素代謝途徑相關(guān)的酶基因都顯著表達(dá)。這表明硫胺素代謝途徑在水仙花響應(yīng)30、35?℃高溫脅迫的過(guò)程中起著重要的作用。硫胺素（維生素B1）是大多數(shù)生物體中必不可少的輔助因子，可作為轉(zhuǎn)酮醇酶（TK）、丙酮酸脫氫酶（丙酮酸脫氫酶）和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物（α-酮戊二酸脫氫酶）^[25]等多種酶類的輔酶，這些酶類在糖酵解、戊糖磷酸循環(huán)及三羧酸循環(huán)等碳水化合物轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用^[26-27]。前人研究表明，硫胺素可以作為一種抗氧化劑，應(yīng)對(duì)氧化脅迫刺激，細(xì)胞內(nèi)硫胺素或者是TPP含量可以增加植物的耐氧化性能，而硫胺素的缺乏會(huì)引起氧化脅迫^[28-29]。周俊等^[30]認(rèn)為硫胺素可以提高線粒體的氧化狀態(tài)，且這一功能具有濃度依賴性。杜馳等^[31]認(rèn)為鹽穗禾的HcThi1基因表達(dá)受鹽脅迫的誘導(dǎo)HcThi1能夠參與鹽穗木鹽脅迫應(yīng)答響應(yīng)。THI1可同時(shí)靶向線粒體和葉綠體^[32]。這些研究結(jié)果都說(shuō)明硫胺素代謝在植物抗性方面發(fā)揮著作用。本研究中只有硫胺素代謝途徑在T15_vs_T30、T15_vs_T35這2個(gè)組合中都得到了顯著富集，且戊糖和葡糖醛轉(zhuǎn)化、乙醛酸和二羧酸代謝等多種與碳代謝相關(guān)的途徑在3個(gè)組合中都得到了顯著富集。說(shuō)明硫胺素代謝途徑可能在水仙花的熱脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 莊曉英， 鄒清成， 盧 鋼， 等. 冷處理對(duì)中國(guó)水仙鱗莖及其不定芽分化過(guò)程中生理生化代謝的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2007（1）： 25-29.

[2] Hanks G R. Variation in the growth and development ofnarcissus in relation to meteorological and related factors[J].Journal of Horticultural Science， 1996， 71（4）： 517-532.

[3] 林小蘋， 張凌霞. 不同貯藏溫度對(duì)水仙花球生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J]. 福建熱作科技， 2008（2）： 5-7.

[4] 林 莉， 黃衛(wèi)國(guó)， 黃清玉. 氣象因素對(duì)水仙花生長(zhǎng)的影響及其在生產(chǎn)上的應(yīng)用[J]. 福建熱作科技， 2016， 41（1）： 34-36.

[5] Djanaguiraman M， Prasad P V V， Boyle D L， et al.High-temperature stress and soybean leaves： leaf anatomyand photosynthesis[J]. Crop Science， 2011， 51（5）： 2125.

[6] Li X F， Shao X H， Deng X J， et al. Necessity of high temperaturefor the dormancy release of Narcissus tazetta var.chinensis[J]. Journal of Plant Physiology， 2012， 169（14）：1340-1347.

[7] Wurr D， Hanks G R， Fellows J R. The effects of bulb storagetemperature， planting date and soil temperature on thegrowth and development of Narcissus bulb units[J]. TheJournal of Horticultural Science and Biotechnology， 2001，76（4）： 465-473 .

[8] 李小方， 王 洋， 鄧新杰， 等. 溫度、GA3 和乙烯對(duì)中國(guó)水仙休眠的解除[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2009， 45（10）： 953-957.

[9] 丁安琪. 溫度對(duì)中國(guó)水仙休眠進(jìn)程相關(guān)生理和基因表達(dá)的影響[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2016.

[10] 許 靜. 中國(guó)水仙休眠調(diào)控相關(guān)基因NFT1 和NEIN3 的功能研究[D]. 上海： 華東師范大學(xué)， 2013.

[11] 宋志丹. 沙冬青轉(zhuǎn)錄組、小RNA 組及低溫應(yīng)答基因表達(dá)譜研究[D]. 長(zhǎng)沙： 中南林業(yè)科技大學(xué)， 2012.

[12] Altschul S F， Gish W， Miller W， et al. Basic local alignmentsearch tool[J]. Journal of Molecular Biology， 1990， 215（3）：403-410.

[13] Buchfink B， Xie C， Huson D H. Fast and sensitive proteinalignment using DIAMOND[J]. Nature Methods， 2015，12（1）： 59.

[14] Conesa A， Terol J， Robles M. Blast2GO： a universal tool forannotation， visualization and analysis in functional genomicsresearch[J]. Bioinformatics， 2005， 21（18）： 3674-3676.

[15] Quevillon E， Silventoinen V， Pillai S， et al. InterProScan：protein domains identifier[J]. Nucleic Acids Research， 2005，33： 116-120.

[16] Changle M， Martin H， Lavanya B， et al. Identification andcharacterization of a stress-inducible and a constitutive smallheat-shock protein targeted to the matrix of plant peroxisomes[J]. Plant Physiology， 2006， 141（1）： 47-60.

[17] Sangster T A， Queitsch C. The HSP90 chaperone complex，an emerging force in plant development and phenotypicplasticity[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2005， 8（1）：86-92.

[18] Sharkey T D， Zhang R. High temperature effects on electronand proton circuits of photosynthesis[J]. Journal of IntegrativePlant Biology， 2010， 52（8）： 712-722.

[19] Todorov D T， Karanov E N， Smith A R， et al. Chlorophyllaseactivity and chlorophyll content in wild and mutantplants of Arabidopsis thaliana[J]. Biologia Plantarum （Prague），2003， 46（1）： 125-127.

[20] Wang J Z， Cui L J， Wang Y， et al. Growth， lipid peroxidationand photosynthesis in two tall fescue cultivars differingin heat tolerance[J]. Biologia Plantarum， 2009， 53（2）：237-242.

[21] Marchand F L， Mertens S， Kockelbergh F， et al. Performanceof high Arctic tundra plants improved during but deterioratedafter exposure to a simulated extreme temperatureevent[J]. Global Change Biology， 2005， 11（12）： 2078-2089.

[22] Apel K， Hirt H. REACTIVE OXYGEN SPECIES： Metabolism，oxidative stress， and signal transduction[J]. Annual Reviewof Plant Biology， 2004， 55： 373-399.

[23] Camejo D， Jiménez A， Alarcón J J， et al. Changes in photosynthetic parameters and antioxidant activities followingheat-shock treatment in tomato plants[J]. Functional PlantBiology， 2006， 33（2）： 177-187.

[24] Tian R G， Guo P Z， Yan H Z. Physiological changes in barleyplants under combined toxicity of aluminum， copper andcadmium[J]. Colloids and Surfaces B： Biointerfaces， 2007，57（2）： 182-188.

[25] Beltramo E， Berrone E， Tarallo S， et al. Effects of thiamineand benfotiamine on intracellular glucose metabolism andrelevance in the prevention of diabetic complications[J].Acta Diabetologica， 2008， 45（3）： 131-141.

[26] 楊卓剛， 劉曉晴. 高等生物丙酮酸脫氫酶復(fù)合體活性調(diào)節(jié)機(jī)制[J]. 生命的化學(xué)， 2008（3）： 304-306.

[27] Chatterjee A， Schroeder F C， Jurgenson C T， et al. Biosynthesisof the thiamin-thiazole in eukaryotes： identification ofa thiazole tautomer intermediate[J]. Journal of the AmericanChemical Society， 2008， 130（34）： 11394-11398.

[28] Ribeiro D T， Farias L P， de Almeida J D， et al. Functionalcharacterization of the thi1 promoter region from Arabidopsisthaliana[J]. Journal of Experimental Botany 2005，56（417）： 1797-1804.

[29] Tunc-Ozdemir M， Miller G， Song L， et al. Thiamin confersenhanced tolerance to oxidative stress in Arabidopsis[J].Plant Physiology， 2009， 151（1）： 421-432.

[30] 周 俊， 孫愛(ài)珍， 曾禮漳， 等. 硫胺素通過(guò)提高線粒體氧化狀態(tài)促進(jìn)植物快速響應(yīng)外界脅迫的研究[J]. 激光生物學(xué)報(bào)， 2012， 21（4）： 340-345.

[31] 杜 馳， 張 冀， 張富春. 鹽脅迫下鹽穗木HcThi1 基因的表達(dá)分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2016， 35（1）：206-212.

[32] Chabregas S M， Luche D D， Farias L P， et al. Dual targetingproperties of the N-terminal signal sequence of Arabidopsisthaliana THI1 protein to mitochondria and chloroplasts[J].Plant Molecular Biology， 2001， 46（6）： 639-650.