基于提高CRISPR/Cas基因編輯效率的研究進展

張玉苗 李蓉 魯瑤 林玉玲 賴鐘雄 徐涵

摘 ?要??CRISPR基因編輯技術發展迅速，為功能基因的研究及遺傳改良提供了技術支持。提高基因組編輯效率成為使用基因編輯技術的基本點，目前已取得了重要進展。本文結合CRISPR/Cas系統的作用原理、晶體結構，著重介紹目前提高編輯效率的最新研究進展，對CRISPR/Cas基因編輯效率的提高進行分析并提出改進策略。

關鍵詞 ?CRISPR/Cas;基因組編輯;基因編輯效率中圖分類號??Q943.2??????文獻標識碼??A

Research Progress on Improving CRISPR/CasGenome Editing Efficiency

ZHANG Yumiao¹， LI Rong²， LU Yao²， LIN Yuling²， LAI Zhongxiong^2*， XUHAN Xu^2，3*

1. College of Biological and Environmental Engineering /?Shandong Key Laboratory of Eco-Environmental Science for the Yellow River Delta， Binzhou University， Binzhou， Shandong?256600， China; 2. Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian?350002， China; 3. Institut de la Recherche Interdisciplinaire de Toulouse， IRIT-ARI， Toulouse 31300， France

Abstract ?CRISPR genome editing technology has developed rapidly and provided technical support for the functional genes research and genetic improvement. High efficiency of genome editing is critical for the application of the technology， and important progresses have been made recently. The present review summarized historic events in the improvement of the technology especially of the editing efficiency in relation to the functional mechanism and structure of the CRISPR/Cas system， and proposed several technological hints to the improvement of the editing efficiency.

Keywords ?CRISPR/Cas; genome editing;?genome editing efficiency

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.013

基因工程，特別是轉基因和基因編輯技術，對人類的福祉和安全帶來機遇和挑戰，堅守生物安全底線早已經是國際社會的共識^[1]，而生物安全的前提是基因工程技術的精準、高效和可控。目前基因測序技術的迅猛發展使很多物種的全基因組序列得到展現。為揭示各基因的功能，對基因序列進行精準而有效的編輯是實驗分子生物學直接和有效的方法。基因編輯（gene editing/ genome editing），不僅有利于基因功能的研究，而且對植物的遺傳育種具有重大意義。本文主要通過對CRISPR/Cas系統的技術原理、晶體結構等進行分析，同時綜合前人對編輯效率提高的研究，以期為提高基因編輯效率提供參考。

1 ?CRISPR/Cas技術的發現

現有的基因編輯系統主要包括鋅指核酸酶（zinc?finger?nucleases， ZFNs）系統、類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，?TALENs）系統以及CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein）系統^[2-3]。ZFN和TALEN技術均依賴蛋白質對DNA序列的特異性識別，載體組裝的復雜性是它們在基因編輯中應用的主要障礙。2013年，CRISPR/Cas[成簇的、規律間隔的短回文重復序列及相關蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/associated protein]技術作為第三代基因組編輯技術迅速發展起來^[4-5]。CRIPSR/Cas體系普遍存在于細菌中，是細菌的一種適應性免疫體系，可使細菌高效辨認和切割入侵的外源核酸。CRISPR/Cas體系可將外源DNA片斷捕獲并將其插入到細菌基因組CRISPR-array中，轉錄產生向導CRISPR/RNA（crRNA）后，進而引導Cas核酸內切酶切割入侵外源核酸。CRISPR/Cas系統包含3種類型：I型，II型和III型;I型和III型系統較為復雜，需要多個Cas蛋白形成復合物開展切割;而II型系統僅需要一個Cas蛋白即可對外源核酸進行更高效、特異的切割，成為基因編輯工具的最佳選擇^[6]。

隨著研究的深入，CRISPR/Cas技術編輯效率（脫靶效應、蛋白切割效率以及遞送方法）的問題亟待解決。

2??CRISPR/Cas系統的技術原理

目前廣泛應用的Cas9蛋白屬于基因編輯的第二類系統^[7]，Cas12a（Cpf1），Cas13a（C2c2）等其他類型的Cas蛋白也相繼被發現^[8-9]，進一步豐富了CRISPR/Cas系統，其中幾個基因編輯系統的基礎信息見表1。在多樣性自然進化系統中這種固有的可編程性的存在，使CRISPR/Cas系統的應用擴展到了精確的基因組編輯領域^[10-11]。

CRISPR/Cas9系統中Cas9核酸酶發揮作用，引導RNA（sgRNA）需要crRNA和tracrRNA形成復合體才能引導Cas9蛋白識別靶位點，然后蛋白的2個核酸內切酶結構域分別對DNA的2條單鏈進行特異性切割^[12];Cas9核酸內切酶對靶位點的識別切割依賴靶序列3′端的PAM序列。不同的Cas9核酸內切酶對應的PAM序列亦不同，例如：spCas9核酸內切酶PAM序列為“NGG”^?[12]，而saCas9核酸內切酶PAM序列為（NNGRRT）^[13]。

CRISPR/Cas12a系統發揮切割作用的核酸內切酶Cas12a（Cpf1）與Cas9蛋白相比，具備以下特點：（1）CRISPR/Cas12a系統的引導RNA不需要tracrRNA，只需要crRNA即可發揮作用，Cas12a-crRNA復合體較小，進入細胞或組織更加容易;（2）核酸內切酶切割位置距離DNA靶點較遠，在編輯位點上為基因組DNA編輯提供了更多選擇;（3）與Cas9切割雙鏈DNA產生的缺口是平末端，Cas12a切割產生的缺口是黏性末端，此末端更易于DNA的插入^[6]。

CRISPR/Cas13a系統發揮切割作用的核酸內切酶為Cas13a（C2c2）蛋白，包含2個高等真核生物和原核生物核苷酸結合結構域，具有RNA介導的RNA酶切割活性，可以切割單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA）^[14]。相比Cas9和Cas12a，Cas13a核酸內切酶使CRISPR系統在基因編輯領域的應用領域更為廣闊。

3??CRISPR/Cas系統的晶體結構

蛋白質的一級結構決定高級結構，高級結構決定生物功能，因此要想充分研究CRISPR/Cas系統的功能以及存在的問題，就需要對其結構有更清楚的了解，解析CRISPR/Cas系統的晶體結構以期找到限制CRISPR/Cas系統發展的關鍵因素。

3.1Cas9蛋白的晶體結構

科研工作者目前已對SpCas9蛋白的晶體結構進行解析，研究發現SpCas9蛋白由1368個氨基酸殘基構成，包括REC-lobe和NUC-lobe 2個葉片狀（lobe）結構（圖1A）分別負責靶DNA的識別以及剪切工作;REC-lobe包括REC1、REC2以及1個長的α螺旋區域3個結構域，NUC-lobe包括RuvC、HNH以及PI（PAM interaction，PI）3個結構域;另外，RuvC結構域可與PI結構域相互作用，形成一個可與sgRNA發生相互作用的帶正電荷的表面^[15-16]。REC-lobe和NUC-lobe間可形成帶正電荷的凹槽，在此凹槽內，SpCas9、sgRNA和靶DNA3者可以相互作用，完成對雙鏈DNA的切割;在相互作用的過程中，首先REC-lobe與sgRNA結合，2者協同作用在靶DNA上尋找PAM序列;然后，sgRNA與靶DNA上的堿基互補配對，REC-lobe完成了對靶DNA的識別;接著，NUC-lobe中的RuvC和HNH結構域分別對靶DNA的2條鏈進行切割，完成NUC-lobe對靶DNA的剪切功能（圖1B）。SpCas9蛋白單獨存在是無活性的，當其與sgRNA結合后，SpCas9蛋白的構象會發生巨大的變化，處于活性狀態，完成對靶DNA的切割^[15-16]。

3.2 Cas12a（Cpf1）蛋白的晶體結構

黃志偉團隊最先解析了LbCpf1系統的晶體結構^[17]。LbCpf1蛋白結構呈三角形結構，中間是一個帶有正電荷的凹槽。在未與crRNA結合時LbCpf1蛋白處于松散的構象，結合后crRNA發卡結構與LbCpf1蛋白緊密結合，LbCpf1-crRNA的復合體由N端螺旋結構域、C端RuvC結構域及中央的寡核苷酸結合結構域（oligonucleo tide-?binding domain，OBD）3部分組成;OBD中的一個凸起的環狀螺旋結構對LbCpf1蛋白與底物的結合起決定性作用;crRNA的3?末端與靶DNA的配對同樣位于三角結構的凹槽內，僅crRNA的重復序列部分就可以引起LbCpf1蛋白構象的巨大改變，不需要tracrRNA的參與（圖2）^[17]。

3.3?Cas13a（C2c2）蛋白的晶體結構

Cas13a（C2c2）蛋白屬于第二類VI型CRISPR/Cas系統的核酸內切酶，對LshC2c2晶體結構的解析顯示，該蛋白同樣包括REC-lobe和NUC-lobe 2個葉片狀（lobe）結構分別負責靶DNA的識別以及靶序列的剪切工作;REC-lobe由N端結構域（N-terminal domain，NTD）和Helical-1結構域構成，NUC-lobe由Helical-2結構域及2個HEPN結構域構成;與SpCas9和LbCpf1蛋白不同的是REC-lobe中的NTD結構域高度保守，NTD結構域與Helical-1結構域間包含有催化pre-crRNA成熟的位點;crRNA與LshC2c2蛋白結合會使LshC2c2蛋白構象發生巨大改變（圖3）^[18-19]。

4 ?基因編輯效率存在問題及研究進展

盡管以CRISPR/Cas為工具的基因編輯技術發展迅速，與其相關的技術還有很多問題亟待解決，如脫靶效應、基因編輯效率不夠高等問題。針對這些問題，人們一直在尋找新的解決方法，例如開發更精確的脫靶效應檢測方法、修飾Cas蛋白或sgRNA從而提高復合物的穩定性，以及嘗試新的遞送方法等。

4.1脫靶與基因編輯

在CRISPR/Cas系統進行定點基因編輯過程中，間隔區序列與目標基因序列進行堿基互補配對時，對目標DNA序列的匹配具有一定程度的容忍度，允許個別堿基的錯配，這一特點導致基因組中與目標DNA序列有較少堿基差別的非目

標DNA也會被誤切，基因編輯中這種現象稱為脫靶現象，脫靶現象的存在很大程度上阻礙了CRISPR/Cas系統在生產實踐中的應用^[20]。

CRISPR/Cas9脫靶現象首先在人類細胞中被驗證^[21]。Keith團隊發現CRISPR/Cas9系統在人類細胞中的脫靶切割頻率較高，甚至存在5個堿基差別的非目標基因仍可被切割，并因此導致突變^[21]。在整個目標基因的識別過程中，sgRNA和PAM發揮非常重要的作用，脫靶的產生也很大程度上源自對目標基因識別準確性的降低;除sgRNA和PAM的影響之外^[22]，Cas9蛋白的構象以及切割方式也影響基因編輯系統的精確度^[23]。表2列舉了目前在sgRNA的設計、PAM序列設計、CRISPR系統的優化（Cas9的構象、Cas9-sgRNA的用量等）等3個方面在降低脫靶效應方面的研究。

4.2?Cas蛋白切割效率

基因組編輯效率（efficiency of genome editing）指轉化事件中目的基因被成功編輯（發生插入、缺失或替換等）的百分數^[47]。基因編輯效率的提高對于CRISPR/Cas9基因編輯技術的開發應用具有重要作用。目前科研工作者主要通過CRISPR/Cas9基因編輯系統的內部序列優化、基因編輯遞送系統的改善以及基因編輯修復策略的改變等方面的來研究提高編輯效率。

4.2.1??優化CRISPR/Cas9基因編輯序列

（1）密碼子優化。根據研究對象進行密碼子優化可以有效提高基因編輯效率。Xing等^[48]研究發現經過密碼子優化后的Cas9基因對玉米基因編輯效率有重要影響，經過玉米自身密碼子優化后的Cas9比經過人類密碼子優化的Cas9獲得的基因編輯效率更高。

（2）啟動子選擇。研究表明使用不同的啟動子啟動sgRNA轉錄對基因編輯效率有影響。Xing等^[48]構建了分別含AtU6-26啟動子、OsU3啟動子和TaU3啟動子的CRISPR/Cas9載體啟動sgRNA轉錄，對目標基因ZmHKT1的基因編輯效率分別是14.5%、26.3%和33.8%;因此在玉米基因編輯系統構建時TaU3啟動子啟動sgRNA轉錄是比較高效的選擇^[48]。不同啟動子啟動Cas9核酸內切酶的表達也對編輯效率有影響;2015年，Svitashev等構建了組成型啟動子玉米泛素啟動子（maize ubiquitin promoter，UBI啟動子）、溫度調控型玉米甘露醇脫氫酶基因啟動子（maize mannitol dehydrogenase gene promotor，MDH啟動子）2種不同啟動子控制經過玉米密碼子優化后的Cas9蛋白表達的CRISPR/Cas編輯系統，研究不同載體系統對玉米無葉舌基因LIG1（Liguleless1）的基因編輯效率，結果表明，組成型UBI啟動子的基因編輯效率比誘導型MDH啟動子的基因編輯效率更高^[49]。而Feng等利用玉米減數分裂特異基因dmc1的啟動子啟動Cas9蛋白，其轉基因陽性愈傷中的突變效率高達100%，并且無脫靶效應，實現了CRISPR/Cas系統高效的基因組編輯^[50]。

（3）靶序列及sgRNA序列優化。研究表明同一目標基因內不同位點的基因編輯效率也是不同的。研究人員對人EMX1基因設計不同位點進行CRISPR/Cas9系統基因編輯脫靶效率的研究結果表明，PAM遠端（5′端）序列的單堿基差異的脫靶率要高于PAM近端（3′端）的8～12個核心序列的單堿基差異;尤其是核心序列中若存在2～3個堿基的差異，脫靶效率大大降低，若存在5個堿基及以上的差異則幾乎無脫靶現象產生^[46]。研究還發現3′端靠近PAM位點第20位、16位、7位、1位均存在堿基偏好性^[51-52]。Farboud等發現sgRNA的3′端若為2個G切割效率最高^[53]。劉小樂團隊分析發現sgRNA的3′端的3個序列為CGG時切割效率較高，而靠近PAM的3′端的4位序列若是T，則切割效率會降低^[52]。

4.2.2 ?改善遞送系統??CRISPR/Cas基因編輯系統需要一定的遞送系統才能進入生物體內發揮編輯功能，如何高效地將編輯系統送入生物體內直接影響到基因編輯的效率。目前遞送系統主要包括傳統的遞送系統如生物學介導的遞送（最常用的為細菌/病毒介導的傳遞系統）、非生物介質遞送、粒子轟擊遞送、電脈沖及電磁輻射遞送等方法，以及近來使用的納米技術遞送系統^[54]。傳統的細菌/病毒介導的傳遞系統是植物遺傳轉化最常用的工具，但由于宿主范圍的限制，僅適用于部分植物物種或組織，同時還涉及將外源基因整合到宿主基因組中;粒子轟擊遞送方法可以通過基因槍或外力將生物分子遞送到多種植物種或組織的細胞中，但是此種遞送系統應用局限性強，且經常由于外力操作而導致組織損傷^[54]。

納米材料目前已經廣泛用于醫學領域中，作為靶向給藥、癌癥治療和遺傳性疾病治療的遞送載體。在植物中，一些研究已經使用納米材料將質粒DNA、dsRNA、siRNA、蛋白質和植物激素遞送到原生質體或細胞中^[54]。目前很多研究已經開發了基于不同材料的納米傳輸載體，主要包括MSN、CNT、LDH、DNA納米結構和磁性納米顆粒^[55-63]。在對納米傳輸載體遞送外源材料進入植物細胞內的研究方面取得了顯著性進展，如功能化的CNT將質粒DNA或siRNA形式的外源性功能基因傳遞到細胞中，從而導致外源基因的強烈表達或高效的基因沉默，并且CNT還可以在一段時間內保護多核苷酸免于核酸酶降解^[58-59];另外CNT在無外部轟擊或化學助劑的情況下可以選擇性地將質粒DNA遞送到葉綠體中^[57]。LDH納米片可以促進dsRNA向模式植物煙草細胞中傳送^[61]。磁性納米顆粒可在有存在磁場的情況下通過花粉孔將外源DNA遞送進花粉中^[62]。對于難以使用常規方法進行遺傳轉化的植物來說，納米技術遞送系統無疑是有效的。這些開創性研究在開發基于納米材料的運輸系統方面取得了重要進展，為植物生物技術的未來應用鋪平了道路。

與以往的轉基因遞送方法相比，基于納米材料的遞送系統為植物基因編輯提供了多種有利條件。首先，它同其他物化方法一樣克服了宿主范圍的限制，能適用于廣泛的植物物種和不同的組織，特別是那些難以進行組織培養獲得再生植株的植物可以通過原位遞送進行轉導;其次，在根據納米材料的特性進行選擇和實現高效遞送的同時，還可將不同的生物分子同時運送到目標位置進行遞送。該方法應用到基因組編輯領域，可通過進一步研究避免外源載體片段進入植物細胞，增加公眾對于基因編輯的接受度^[54]。圖4展示了納米材料介導的植物基因工程的過程。

4.2.3 ?改善DSB修復策略??Cas9核酸內切酶切割目標DNA序列可引起DNA雙鏈斷裂（double strand break，DSB）。DSB可由2種內源性的修復機制修復，非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源重組介導的修復（homology-directed repair，HDR），從而實現基因的定向敲除、敲入等編輯過程^[64]。因NHEJ修復易于出錯，目前大部分基因編輯研究傾向于利用HDR修復DSB的策略。由于NHEJ修復途徑

也屬于細胞內源性修復機制，會與HDR修復進行競爭，因此若能抑制NHEJ的效率從而提高HD的修復效率，則會提高基因編輯的效率。目前已有一些方法經研究證明對NHEJ修復過程有抑制作用，如使用Scr7這種DNA連接酶IV抑制劑抑制NHEJ活性^[65]，適當改造基因編輯中的供體質粒^[66]，設計非同源依賴的靶向整合（homology-in-?dependent targeted integration，HITI）方法^[67]等，這些方法均可有效提升基因編輯的效率。

5??提高基因編輯效率的其他幾個方面

隨著人們操控基因組技術的進步，有3項基因組技術在生物學領域的研究中起著舉足輕重的作用：高通量基因組測序技術、CRISPR基因編輯技術和單細胞基因組學（單細胞測序）。

基因組學是闡明整個基因組的結構、結構與功能的關系以及基因之間相互作用的科學。從全基因組的整體水平而不是單個基因水平，研究生命這個具有自身組織和自裝配特性的復雜系統，認識生命活動的規律，更接近生物的本質和全貌。高通量測序技術（high-throughput sequencing）又稱下一代測序技術（next-generation sequencing technology），以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。

對編輯效果，包括打靶效率（targeting efficiency）和脫靶效應的檢測是評估基因組編輯實驗成敗的關鍵。隨著高通量測序的普及，全基因組測序將越來越普遍（花更少的時間和金錢），因此整合高通量測序與相關計算分析，利用CRISPR/?Cas介導的基因組編輯實現全基因組水平基因的功能篩選是基因編輯效果檢測評估的趨勢。

前人對于提高基因編輯效率做了大量的研究，尚未從根本上解決基因編輯過程中精準有效切割的問題。要想解決這一問題需內因與外因相結合進行全面考量。從目前研究較多的CRISPR/?Cas系統序列特征（GC含量、堿基頻率特征、sgRNA與靶向DNA的錯配特征、切割位點對堿基序列的偏好性等）延伸至物理學、化學、生物學各方面的多種影響因素。

單細胞測序以單個細胞為單位，通過全基因組或轉錄組擴增，進行高通量測序，能夠揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態，反映細胞間的異質性，在腫瘤學、發育生物學、微生物學、神經科學等領域發揮重要作用，正成為生命科學研究的焦點單細胞測序技術^[68]，特別是單個細胞分離并逐個測序技術。單細胞測序技術發展下去一個很可能的結果，就是做到基因可控性。可控基因技術在單細胞測序基礎上進行數據總結，對基因行為的結果達到可預測水平，從基因層面全面獲知細胞乃至植物個體的生理變化，這一信息的反饋，成為基因編輯結果的實時評價工具，將對提高基因編輯效率發生根本性的智能指導作用。

對于植物基因編輯而言，提高CRISPR/Cas系統進入細胞的效率，影響轉導遞送的生物物理學層面上的障礙主要是細胞壁、細胞膜和核膜的通透性，也會涉及染色體形態結構以及核小體的結構等的問題^[69]。在植物胚性細胞一般細胞壁比較薄，細胞壁結構相對松散，轉導不僅因其發育潛能高而提高效率，而且因為細胞壁的松散而容易侵染遞送和理化方式的遞送，從而提高最終的基因編輯效率。核膜對DNA、RNA和蛋白質都有屏障作用^[70-71]。充分利用細胞周期中M期核膜解聚的窗口期（分裂前期至分裂后期，prophase-?telophase/M）進行遞送是對核膜造成的障礙進行針對性改善的有效措施。這種方法可以與同步化的誘導相結合，使更多的細胞在轉導中處于M期狀態。一些脅迫因子也可以短時間改變細胞壁、細胞膜的通透性，有助于細胞周期和遞送的調節^[72-73]。借助納米技術進行CRISPR/Cas系統遞送方法的開發也是比較理想的一種方式，有待進一步開發研究。目前在核小體不易展開的物理死角處如何進行基因編輯尚無確切研究數據^[74]。

提高CRISPR/Cas系統的效率，在生化層面上，主要以CRISPR/Cas系統作用的原理以及晶體結構為基礎，研究晶體結構的熱力學特征，通過對關鍵堿基進行改變以及利用特定的化學修飾方法，改變蛋白的構象，提高引導RNA以及Cas蛋白的活性及穩定性，進而增強引導RNA的引導特異性以及Cas蛋白對于目標序列的切割效率。在生物學層面上，以細胞生長狀態和發育潛能為基礎，建立高效同步的繁殖體系^[75]，對基因編輯效率的提高具有明確的效益。在染色質狀態特征等基礎上，研究DNA甲基化、組蛋白乙酰化、核小體占位、以及編輯位點是否處于超敏感位點等對編輯效率的影響^{[24， 76-77]}，使得CRISPR/Cas系統進行基因編輯時所處的細胞多數為可以行使功能的活細胞，同時Cas蛋白進行切割時處于染色質疏松狀態，DNA與組蛋白解聚，以及細胞分裂周期S期到G2期^[78]。

本文在對CRISPR/Cas系統的技術原理、晶體結構等進行分析的基礎上，著重分析CRISPR/?Cas系統序列特征，并討論了物理學、化學、生物學等多種因素的影響，認為基因編輯效率的提高可以通過內外因結合的方式，在基因編輯系統本身改造、基因編輯系統遞送時期和遞送方式選擇以及影響酶活和蛋白穩定性等方面進行優化。

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