山奈素對大鼠動脈性勃起功能障礙治療作用的機制研究

孟 宇 ，王李卓 ，陳靠山

勃起功能障礙（Erectile Dysfunction，ED）是男性的常見病和多發病，正常的血管和細胞功能是維持陰莖勃起的基礎，若血管發生病變則導致ED疾病的發生，占到ED病的50%［1］.神經遞質NO和NOS存在于多種細胞和組織中，作為陰莖海綿體勃起和松弛的主要神經遞質，目前比較統一認可的觀點是通過NO-cGMP這個信號傳導通路來調節陰莖組織對性刺激的反應，即勃起和舒張［2］，所以，NO和NOS在勃起功能中的作用至關重要［3］.ED病治療方法多是藥物性治療為主，其副作用大而且價格昂貴［4］.本實驗室已從牛蒡根中分離出黃酮類化學物質山奈素［5］，初步實驗證實牛蒡根成分牛蒡低聚果糖和山奈素具有治療ED病的作用［5-7］.其機制尚不清楚，本文檢測陰莖組織中NO含量和NOS的活性，以及陰莖和睪丸組織中NOSmRNA的表達情況，來探討其治療效果的可能機制.

1 材料

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠48只，6～7周齡，體重（180±20）g，由皖南醫學院動物房提供，飼養于清潔、適溫的房間，正常飲食.

1.2 藥品試劑

山奈素由牛蒡根水提取中提取純化，NO檢測試劑盒（KGT00725）；NOS檢測試劑盒（KGT020）；Trizol總RNA提取試劑（KGA1203），RT-PCR試劑盒（KGA1303），均購置于南京凱基生物科技發展有限公司.

2 實驗方法

2.1 NO含量和NOS活性的測定

大鼠于灌胃處理2 h后給予2%戊巴比妥鈉2 mL腹腔注射麻醉，取出陰莖和睪丸組織，加入生理鹽水，冰浴進行操作，研磨勻漿，按測定試劑盒說明書進行操作.

2.2 動物分組及模型構建

將雄性SD大鼠48只隨機分成6組：假手術組、模型組、山奈素50 mg·kg-1組和山奈素100 mg·kg-1組，進行髂內動脈結扎給動物造模型，其中假手術組也需要進行手術開腹，但無需結扎動脈.模型成功后各個組給予每天一次用藥，連續用藥3周.

2.3 RNA的提取及純度的鑒定

陰莖和睪丸組織的處理：手術取出組織80 mg，按試劑盒的說明提取RNA.按照1 mL Trizol試劑加入1 mL 75%的乙醇的比例；其沉淀不可太干燥，以免后期不好溶解.最后加入50 μL DEPC處理過的水溶解RNA沉淀，待完全溶解后立即置于冰上或于-70℃保存.按公式來計算濃度，RNA的濃度=OD260×稀釋倍數×0.04 μg·μL-1，OD260/280在1.8～2.1范圍內可認為RNA純度高.

2.4 RT-PCR反應的操作步驟

（1）RT反應.使用前對每個組進行混勻，動作要輕，低速離心20 s；在無核酸酶的PCR管中加入相應體積的各個組份.70℃保溫10 min，然后冰浴5 min；往0.2 mL PCR管依次加入下列組份：RNase抑制劑（40 u/μL），Buffer，dNTPs，DTT（1M），逆轉錄酶，無核酸酶的雙蒸水；混勻后，低速2000 rpm離心20 s；繼而在42℃保溫1 h，然后70℃保溫15 min；其產物可以保存在-20℃冰箱或者用于下步反應.

（2）PCR反應.①冰浴上進行操作，事先準備好無菌、無核酸酶的0.2 mL離心管，在離心管中依次加入相應的各個組份，最后滅菌雙蒸水至總體積50 μL.輕輕混勻，低速2 000 rpm離心20 s后進行PCR擴增；反應結束后，取5 μL擴增產物，用瓊脂糖凝膠電泳的方法來鑒定反應產物.②PCR擴增條件.nNOS：變性：95℃*30 sec，退火：55 ℃*30 sec，延伸：72 ℃*35 sec；32個循環；iNOS：變性：95 ℃*30 sec，退火：55℃*30 sec，延伸：72 ℃*35 sec；32個循環；eNOS：變性：95 ℃*30 sec，退火：55℃*30 sec，延伸：72℃*35 sec；32個循環.

3 結果

3.1 山奈素對A-ED大鼠陰莖組織中NO含量和NOS活性的影響

山奈素對A-ED大鼠陰莖組織中NO含量和NOS活性的影響如表1所示.

由表1可知，給予山奈素100 mg·kg-1組與模型組相比較，陰莖組織中NO含量和NOS的活性顯著提高（p＜0.01），山奈素50 mg·kg-1組與模型組比較，能明顯提高陰莖組織中NO和NOS的含量（p＜0.05）.結果說明山柰素可以提高陰莖組織中NO含量及NOS的活性.其中假手術組作為陰性對照組，說明模型建立成功.

表1 山奈素對A-ED大鼠陰莖組織NO含量和NOS活性的影響

3.2 山奈素對A-ED大鼠陰莖組織中3種NOS亞型基因表達水平的影響

山奈素對A-ED大鼠陰莖組織中3種NOS亞型基因表達水平的影響結果如表2所示.

表2 山奈素對大鼠陰莖組織中3種NOS亞型基因表達的影響

從表2可以看出，給予山奈素灌胃處理后，山奈素100 mg·kg-1組與模型組大鼠比較，能顯著增加eNOS和nNOS基因的表達，對iNOS基因的表達也有一定的上調作用.山奈素50 mg·kg-1組與模型組大鼠比較，能明顯增加各組NOS的基因表達；說明山奈素對陰莖組織中NOS的基因表達有上調作用.

3.3 山奈素對A-ED大鼠睪丸組織中3種NOS亞型基因表達水平的影響

給予山奈素灌胃處理后，山奈素對A-ED大鼠睪丸組織中3種NOS亞型基因表達水平均有不同程度的影響，結果見表3.

表3 山奈素對A-ED大鼠睪丸組織中3種NOS亞型基因表達水平的影響（xˉ±s）

圖1 山奈素對A-ED大鼠睪丸和陰莖組織3種亞型NOS表達的電泳圖

從表3可以看出，山奈素50 mg·kg-1能明顯提高A-ED大鼠睪丸組織中nNOS和eNOS基因的表達水平，100 mg·kg-1能夠顯著提高nNOS和eNOS基因的表達.因此，山奈素能夠增加睪丸組織中nNOS和eNOS的基因表達，電泳圖見圖1.

4 討論

勃起功能障礙作為男性的一種常見和多發疾病，嚴重影響身心的健康.此病有多種類型和病因，陰莖動脈供血不足，是導致本病發生的一個重要多見原因［8］.EL-SAKKA等［9］通過結扎雙側髂內動脈的方法制作了大鼠血管性ED模型，研究證實NOS的表達水平和活性的變化與A-ED的發病機制有關.對于陰莖勃起的信號通路，目前比較統一的觀點NO是通過NO-cGMP這個信號傳導通路來調節陰莖組織對性刺激的反應，陰莖副交感神經、非腎上腺素、非乙酰膽堿能神經末梢、陰莖海綿體血管內皮細胞內的一氧化氮合酶（NOS）將精氨酸催化成一氧化氮（NO）［10］，從而使陰莖組織進行舒張勃起.NOS包括神經型（nNOS）、內皮型（eNOS）和誘導型（iNOS）3種類型.nNOS主要存在于中樞神經系統及周圍神經系統中，在神經組織內產生一氧化氮，協助細胞間的信號傳導.eNOS于血管內產生一氧化氮，可以協助調節血管功能.iNOS主要利用一氧化氮的氧化應激作用，協助巨噬細胞在免疫系統中對抗病原體.nNOS和eNOS是參與陰莖勃起的重要物質，也與實驗結果吻合.結扎血管可以導致陰莖海綿體的缺血缺氧，當機體受到性刺激后，缺血缺氧導致海綿體結構和功能損傷，降低了NOS 3個亞型的表達，NO產生減少，NO信號功能減弱，海綿體平滑肌舒張功能減弱而導致ED病的發生［11-13］.本實驗根據De young等的方法，結扎大鼠髂內動脈，建立模型組，通過數據可以知道，ED模型組的3種一氧化氮合酶亞型基因表達明顯降低，證明該模型可以作為血管性ED模型開展實驗，進行下一步的研究工作.經過三周不同劑量的山奈素灌胃給藥后，能夠明顯地提高A-ED大鼠陰莖組織NOS的活性，使得NO含量增加，給藥組對NOSmRNA的基因表達也有明顯提高.

實驗結果表明，其機制可能是NOS的活性提高使NO的含量增加，NO-cGMP信號通路被激活，從而改善ED的癥狀.前期實驗證實牛蒡根水提取具有治療ED病的作用［7］，且對陰莖海綿體平滑肌細胞進行原代培養可行［14］，后期將從陰莖海綿體平滑肌和分子信號通路等方面繼續進行研究ED病的治療方法機制.