脊髓小膠質細胞對小鼠肝臟缺血再灌注損傷后認知功能障礙的影響

鮑樂樂，姜文荃

認知功能障礙是由于多種原因導致的理解能力、記憶力、注意力、精神活動等發生障礙的中樞神經系統疾病。 老年人群神經系統退化，是認知功能障礙的好發人群［1］。臨床研究表明，認知功能障礙能夠增加患者的住院時間和醫療費用，甚至增加患者圍術期的死亡率［2］，因此研究認知功能障礙的發病機制對臨床具有重要意義。 目前認為，認知功能障礙的發病原因多種多樣，中樞神經炎癥反應可能是其重要的發病基礎［3］，而常見的主要影響因素包括年齡、手術應激、麻醉方式、疾病類型、血栓形成等，手術操作導致的急性應激反應是加重認知功能障礙的重要因素，尤其是器官缺血再灌注損傷引起的全身性炎癥反應能夠加重認知功能障礙的發展［4］。認知功能障礙是老年肝臟手術患者常見的并發癥之一， 肝臟缺血再灌注損傷 （hepatic ischemiareperfusion injury，HIRI） 通常發生于肝臟切除術或肝移植的患者中，短暫阻斷肝臟血流是減少術中出血的常用方法，但這可直接影響患者預后，不僅加重肝臟功能損傷， 甚至引起級聯性的炎癥反應，通過激活網狀內皮系統釋放大量炎性因子，介導遠隔器官如腸、脾、肺、腎甚至脊髓、大腦等中樞神經系統的損傷［5］。 因此，該研究重點討論HIRI 是否通過激活脊髓內小膠質細胞誘發脊髓層面的神經炎癥反應，參與認知功能障礙的發生發展，為臨床預防肝臟手術患者認知功能障礙的發生提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑健康老年雄性C57/BL 小鼠（4月齡，25～30 g） 由中國科學院上海實驗動物中心提供，12/12 h 光照條件空調室內飼養，室溫22～25 ℃，濕度40%～60%，自由進水和食物。 實驗所用試劑主要有戊巴比妥鈉（Sigma，St. Louis，MO，USA）50 mg/kg 腹腔注射， 小膠質細胞激活抑制劑米諾環素（Minocycline）（Sigma，St. Louis，MO，USA）50 μg 進行鞘內給藥，抗體主要包括小鼠來源的小膠質細胞激活標志物IBA-1（abcam，USA）、小鼠來源GAPDH（CST，USA）、 辣 根 過 氧 化 物 酶 （horse reddish peroxidase，HRP） 標 記 的 山 羊 抗 小 鼠 二 抗（CST，USA）以及小鼠IL-1β ELISA Kit（invitrogen，USA）、IL-6 ELISA Kit （abcam，USA）、TNF-α ELISA Kit（invitrogen，USA）。 小鼠隨機分為四組（n=15）：假手術組 （sham）、 假手術+米諾環素干預組 （sham+minocycline）、HIRI 組、HIRI+ 米 諾 環 素 干 預 組（HIRI+minocycline）。

1.2 鞘內置管為在實驗過程中對小鼠進行脊髓米諾環素給藥，對小鼠均進行鞘內置管。 小鼠麻醉后腰中線備皮消毒后切開約1 cm 的小口， 剪開筋膜，一手托起小鼠，盡量暴露L3～L4間隙，用小剪刀垂直L3棘突剪開，暴露三角間隙，用小針穿破硬膜，可見小鼠甩尾反射， 夾取PE-10 導管沿穿刺孔插入，置入約0.5 cm 后可見腦脊液流出，即可封閉管口。 導管周圍敷以氨芐青霉素粉末，依次縫合，妥善固定導管于肌肉和皮膚，在皮下再敷以氨芐青霉素粉末，術后單籠飼養［6］，分別在HIRI 術前1 d 以及術后1 d 給予小鼠米諾環素50 μg 進行干預。

1.3 HIRI 模型的建立通過夾閉門靜脈阻斷肝臟70%的血供創建HIRI 模型［7］。 腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg） 麻醉后取腹部正中切口行開腹手術，分離肝十二指腸韌帶并充分暴露第一肝門，使用動脈夾小心地夾閉左肝前葉和肝中葉的肝動脈以及門靜脈，并確保肝右葉和尾狀葉血流通暢以產生70%的肝缺血。 60 min 后移除夾子使血液重新灌注，隨后分層縫合腹部切口。 整個過程使用加溫毯維持小鼠體溫在36～37 ℃之間。 假手術組除未進行夾閉第一肝門血管外所有操作均相同。

1.4 血清ALT、AST 及肝臟中性粒細胞計數、濕干比測定HIRI 術后1 d 取小鼠靜脈血1 ml 并常溫下1200 r/min 離心1 min，通過日立747 全自動生化分析儀（德國）測定血清中的ALT 和AST 水平。 將肝組織的HE 染色切片在高倍鏡下隨機選取20 個視野進行中性粒細胞計數，以評價其炎癥程度。 同時，切除肝組織，稱量濕重（W）后放入95 ℃的電熱恒溫干燥箱中烘干24 h 后進行稱重即為干重（D），兩者比值（W/D）即為肝臟組織水腫程度。

1.5 水迷宮測試用Morris 水迷宮 （XR-XM101）分別評估HIRI 模型創建后第1、3、5、7 天小鼠的認知功能改變。 實驗過程中保持水溫在25 ℃左右。HIRI 前5 d 開始，每天將小鼠放入水池中使其自由游泳5 min 進行環境適應。在定位巡航階段，將小鼠隨機的在四個象限的固定入水點面向池壁放入水池，觀察并記錄小鼠尋找并登上隱匿于第三象限水面下平臺所用時間即逃避潛伏期，若小鼠在60 s 內沒能登上平臺則將其引導至平臺并記錄60 s 為其逃避潛伏期。 隨后進行空間探索實驗，撤去平臺，選取原隱匿平臺所在象限（第三象限）的對側象限（第一象限）的入水點，將小鼠面向池壁放置入水，觀察并記錄小鼠找到第三象限平臺所在位置的時間，并記錄其在第三象限停留的時間以及穿越平臺位置的次數。

1.6 免疫熒光將小鼠麻醉后， 用0.1 mol 磷酸鹽緩沖液（PBS）和4%多聚甲醛灌流。將脊髓膨大段取出后用4%多聚甲醛后固定， 并移入30%蔗糖溶液中進行脫水。用冷凍切片機（Leica，Germany）將脊髓切成20 μm 脊髓片， 在5%山羊血清中室溫下封閉1～2 h，然后在4 ℃下分別加入小鼠來源IBA-1 抗體（1∶500）孵育過夜，PBS 洗3 次，5 min/次，加入山羊抗小鼠IgG（1∶1000）避光孵育2 h。 用熒光顯微鏡拍攝，然后通過Photoshop 軟件合并。

1.7 Western Blot將小鼠麻醉后迅速取出脊髓膨大段并放入液氮中保存。將組織加入到200 μl 裂解液中（RIPA∶蛋白酶抑制劑為100∶1）超聲勻漿，并在4 ℃條件裂解30 min。 裂解完成后高速離心（13 000 rpm，15 min，4 ℃）取上清。 隨后用BCA 法測定總蛋白濃度并在99 ℃條件下變性10 min。 取30 μg 蛋白樣本進行8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）， 采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF 膜上，經5%脫脂奶粉封閉2 h 后，分別加入小鼠來源IBA-1 抗體（1∶1000）、小鼠來源GAPDH（1∶5000）一抗4 ℃孵育過夜。 TBST 洗膜3 次，5 min/次，分別加入HRP 標記的山羊抗小鼠二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，加入抗小鼠二抗（1∶5000，CST）室溫孵育2 h，洗膜后加入顯影液進行曝光， 使用Image J 軟件分析各蛋白條帶灰度值進行比較分析，其中目的條帶的相對含量值為目的條帶灰度值/GAPDH 灰度值。

1.8 微透析技術微透析技術用來檢測HIRI 模型后脊髓層面的炎癥因子的釋放量。 將小鼠放置于立體定位儀上并用2%七氟烷吸入麻醉并維持， 于腰部中間皮膚切口，摘除椎板暴露部分脊髓，插入透析針，并保持透析管同脊髓在同一平面并固定。 打開微透析泵并填充透析液， 平衡2 h 后收集透析液并進行炎癥因子的測定。

1.9 ELISA 測定炎癥因子采用ELISA 方法測定微透析過程獲得的脊髓透析液中IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子的濃度。根據ELISA 試劑盒的使用說明，所有試劑均平衡至室溫。 將獲得的透析液按照一定比例稀釋，每孔加入100 μl 的試劑盒樣本稀釋液， 每孔依次加入標準品和各組樣本100 μl，室溫孵育2 h，棄去孔內液體，用洗滌液反復洗滌4次，每孔均加入底物溶液200 μl，室溫避光孵育20 min 后加入50 μl 的終止液并混勻， 靜置2 min開始顯色。 使用酶標儀（Eppendorf）在450 nm 波長處測定每孔的吸光度。

1.10 統計學分析采用Graphpad prism 5 進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，不同組別和時間點的數據分析采用多因素重復方差分析方法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清ALT、AST 及中性粒細胞計數、W/D 變化如圖1 所示，HIRI 術后肝功能指標ALT、AST顯著升高， 同假手術組相比差異具有統計學意義（圖1A、1B，P＜0.05）， 說明HIRI 小鼠肝功能受損。HIRI 小鼠肝臟中性粒細胞計數以及W/D 同樣明顯高于假手術組 （圖1C、1D，P＜0.05）， 進一步說明HIRI 導致肝臟水腫以及炎癥反應增強， 提示HIRI小鼠模型創建成功。

圖1 血清ALT、AST 及PMN 計數、濕干比變化

2.2 HIRI 及脊髓小膠質細胞激活對小鼠認知功能的影響同假手術組相比，HIRI 小鼠術后1、3、5、7 d 的水迷宮實驗逃避潛伏期明顯延長， 而通過鞘內注射米諾環素抑制脊髓小膠質細胞激活后小鼠逃避潛伏期在3、5、7 d 有所減少 （圖2A，P＜0.05），且HIRI 組3、5、7 d 的目標象限停留時間和5、7 d的穿越平臺次數顯著減少，而通過鞘內注射米諾環素后小鼠目標象限停留時間及穿越平臺次數在5、7 d 有所增加（圖2B、2C，P＜0.05），差異具有統計學意義，提示HIRI 能夠加重小鼠的認知功能障礙，而脊髓小膠質細胞的激活在HIRI 導致的認知功能障礙過程中發揮重要作用。

圖2 HIRI 及脊髓小膠質細胞激活對小鼠認知功能的影響

2.3 HIRI 對小鼠脊髓小膠質細胞激活的影響為進一步研究小膠質細胞在HIRI 后對認知功能障礙的影響，筆者觀察了脊髓小膠質細胞的變化。 免疫熒光顯示HIRI 小鼠脊髓背角小膠質細胞激活標志物IBA-1 明顯增加，而鞘內注射米諾環素后小膠質細胞激活有所減弱，差異具有統計學意義（圖3A、3B，P＜0.05），且Western Blot 結果進一步說明HIRI上調小鼠脊髓IBA-1 蛋白的表達，而米諾環素干預減弱HIRI 對小鼠脊髓IBA-1 蛋白影響（圖3C、3D，P＜0.05），提示HIRI 能夠增強脊髓小膠質細胞的活動。

2.4 HIRI 對小膠質細胞介導的炎癥因子釋放的影響為了研究HIRI 小鼠脊髓小膠質細胞介導的炎癥反應的變化，通過微透析技術收集脊髓微環境的腦脊液進行分析。 ELISA 結果如圖4 所示，HIRI 小鼠脊髓內IL-1β、IL-6、TNF-α 三種炎癥因子的合成釋放明顯增加， 說明HIRI 增強了脊髓內炎癥反應， 而在鞘內注射米諾環素后濃度顯著下降 （P＜0.05）， 說明小膠質細胞介導了脊髓炎癥反應，HIRI通過小膠質細胞影響脊髓內炎癥反應的發生進一步影響小鼠的認知功能。

圖3 HIRI 對小鼠脊髓小膠質細胞激活的影響

圖4 HIRI 對小膠質細胞介導的炎癥因子釋放的影響

3 討 論

認知功能障礙是麻醉和手術后老年患者神經系統常見的并發癥，嚴重影響老年患者術后恢復及生活質量，尋找圍術期能夠預防老年患者術后認知功能障礙的方法意義重大。 該研究發現，肝臟缺血再灌注損傷能夠顯著加重小鼠的認知功能障礙，而脊髓內小膠質細胞介導的神經炎性反應在此過程中發揮重要作用。

作為中樞神經系統內的一種免疫巨噬細胞，小膠質細胞在脊髓的免疫應答過程中發揮重要作用。中樞內小膠質細胞對各種炎性刺激異常敏感，神經損傷、感染和促炎因子的釋放均能誘導小膠質細胞過度激活及數量增加并出現M1 極化， 進一步改變施萬細胞和軸突的功能和結構特性，導致多種細胞因子的釋放， 包括IL-1β、IL-6、 白血病抑制因子、TNF-α、TNF-β 等［8］。 TNF-α 作為促炎細胞因子，又可反過來激活神經膠質細胞進行神經炎癥調節。 而IL-1β 在認知功能障礙的早期發展過程中起著重要作用，Cibelli 等［9］通過敲除IL-1β 受體可以顯著減輕認知功能障礙的癥狀，抑制IL-1β 的釋放可以延緩認知功能障礙的進展。 肝臟缺血再灌注損傷過程中肝臟免疫細胞釋放多種促炎因子入血，通過損傷血腦屏障內皮細胞增強其通透性并大量進入中樞神經系統，激活敏感的神經膠質細胞從而激活中樞的炎癥反應［10］。 同時，細胞內核轉錄因子NF-κB 可迅速對外界刺激做出反應，啟動細胞核內相關炎癥因子的轉錄過程，參與到中樞內神經系統的炎癥反應，甚至損傷細胞線粒體功能，導致細胞內能量供需失衡，導致神經元非正常死亡，影響認知功能［11］。該文同樣證實了肝臟缺血再灌注損傷顯著增加了脊髓內小膠質細胞介導的炎癥因子的釋放，促進了認知功能障礙的發展。 同時，氧化應激在認知功能障礙的病理過程中發揮重要作用。 在肝臟缺血早期，體內主要的抗氧化系統如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等活性增高以消除氧自由基。 但當再灌注損傷發展到一定程度時這種平衡被打破，抗氧化系統功能減弱，氧自由基沉積于肝組織和脊髓、大腦神經元，炎細胞浸潤和炎癥因子的釋放同時會造成更多自由基沉積，進一步加重神經元損傷［12］。

在術后認知功能障礙發生發展過程中起主導作用的是中樞神經系統，尤其是大腦的海馬區域神經元發生炎癥、凋亡等病理改變，且海馬內小膠質細胞介導的一系列反應導致的神經元病理改變在術后認知功能障礙的發展中至關重要。 肝臟缺血再灌注損傷后釋放的多種物質可通過受損的血腦屏障進入中樞，其可通過直接或間接的方式到達并作用于海馬。 脊髓背角有特定的區域投射至大腦海馬區域，此通路在神經營養因子、第二信使等存在密切交流，因此脊髓的損傷能夠通過神經投射對海馬區域產生重要影響，同時脊髓小膠質細胞在此過程中發揮重要作用，此為間接途徑。 誠然通過藥物直接干預海馬區域的病理進程能夠對認知功能障礙產生更直接的影響，但不可否認在脊髓層面干預對海馬區域也會產生重要影響， 兩者具有協同效果。另一方面，肝臟缺血再灌注損傷往往發生在肝臟手術過程中，若麻醉方法復合腰硬聯合麻醉等椎管內麻醉方法，此時即可通過脊髓水平的干預對海馬產生影響，從而預防術后認知功能障礙，選擇缺血再灌注損傷后脊髓炎癥反應對術后認知功能障礙的影響， 進一步補充解釋了認知功能障礙的發病機制，但脊髓激活的小膠質細胞通過何種方式影響到海馬區域，以及脊髓對海馬區域影響的程度，仍有待進一步研究探索。

綜上所述，肝臟缺血再灌注損傷通過小膠質細胞活化促進脊髓內炎癥反應的發生，從而影響小鼠的認知功能。 因此，在肝臟手術過程中提前改變小膠質細胞的功能狀態，或者通過某種方式減輕肝臟缺血再灌注對中樞神經系統的炎癥影響，可以減少術后認知功能障礙的發生率，提高圍術期患者生存率。