改良Feulgen 染色法檢測標本細胞DNA 的效果評估

鄭 濤，陳偉芳，張夢琦，韓永良，魏淑飛

宮頸癌是一種常見的惡性腫瘤，已成為威脅女性健康的第二大殺手，宮頸癌的早期診斷，早期治療是提高患者生活質量的有效手段。 隨著分子病理檢測技術的不斷發展，DNA 倍體分析廣泛應用，為癌癥的早期診斷和篩查提供了重要的檢測途徑。

Feulgen 染色法是DNA 染色的標準染色方法，其原理在于通過酸水解使DNA 中嘌呤脫氧糖苷鍵打開，暴露出醛基，然后通過Feulgen 液顯色［1，2］，從而達到檢測標本中細胞DNA 的變化情況。 經典Feulgen 染色法操作時間較長，需要長達4 h，經過不斷實驗摸索和反復改進， 筆者探索出一種改良Feulgen 染色法，并與經典Feulgen 染色法進行了比較。

1 資料與方法

1.1 標本來源及分組收集九江學院附屬醫院婦科門診2018 年12 月1 日—12 月20 日進行宮頸癌普查檢測所取標本300 例，每例標本進行液基制片各3 份，隨機分為標準組，實驗組1，實驗組2，分別進行染色。 每批每組染色時均放入標準干片同時染色，進行質控。標準組是按4 h 流程的常規標準程序染色， 實驗組1 和實驗組2 均是按30 min 的改良Feulgen 法染色。

標準片30 例，由麥克奧迪實業有限公司提供，隨機分成標準組，實驗組1，實驗組2，標準組采用傳統Feulgen 染色法， 實驗組1 及實驗組2 采用改良Feulgen 染色法。

1.2 試劑與儀器固定液：使用甲醇、福爾馬林和冰醋酸（85/10/5%v/v）的混合液（即BS 固定液）進行固定；5N 鹽酸：濃鹽酸與蒸餾水以42：58（v/v）比例混合。 DNA 染液（由廈門邁克奧迪公司提供）與5N鹽酸及蒸餾水按比例配置，攪拌60～90 min 后使用。

儀器：Motic DNA 圖像分析系統 （麥克奧迪實業集團有限公司）SHP-250FE 智能生化培養箱 （上海三發科學儀器有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 經典Feulgen 染色法 標準組步驟： 按說明書進行操作。

1.3.2 改良Feulgen 染色法 （1）B.S 固定液中固定5 min（水浴50 ℃）；（2）流水洗滌4～5 次；（3）5N 鹽酸酸解6 min （水浴50 ℃）；（4） 流水洗滌4～5 次；（5）將切片置染液中染色7 min（25±2 ℃）；（6）流水洗滌4～5 次后，水中繼續浸洗15 min；（7）脫水：置50%—75%－100%－100%—100%乙醇中逐級脫水，各1 min；（8）濕式封片：切片迅速依次轉入無水乙醇∶二甲苯 （1∶1）—100%二甲苯—100%二甲苯，各1～3 min； 最后一張一張取出， 滴加中性樹膠封片；（9）進行掃描及圖像分析。

另取標準片分別用兩種方法進行染色，分析新方法的重復性。

1.4 統計學處理應用SPSS 19.0 統計軟件，實驗數據以（±s）表示，組間差異按方差分析進行t 檢驗。 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩種方法染色圖像分析檢測鏡下效果細胞輪廓清楚，核染色深，背景干凈。 見圖1。

圖1 染色圖像分析檢測結果

2.2 兩種染色法對宮頸標本二倍體細胞核IOD、DI、CV 值一致性的影響經麥克奧迪實業有限公司提供的Moticymeter 掃描后Classify 分析系統分析，各組常規標本（除微生物感染標本）各組染色直方圖及散點圖（圖2），實驗組宮頸標本二倍體細胞核IOD、DI、CV 值與標準組對比（P＞0.1），差異無統計學意義。 按此標準對各實驗組染色質量與標準組進行比較，無統計學意義（P＞0.05，表1）。

2.3 兩種染色法對標準片細胞核IOD、DI、CV 值一致性的影響傳統方法染色細胞核IOD 平均值為112.4，實驗組分別為110.7 及108.2，與標準組對比，差異無統計學意義（P＞0.1）（表2），表明此改良方法重復性高，穩定性好。

3 討 論

隨著分子病理的研究不斷深入，分子水平的研究結果引起了眾多學者的關注， 目前Feulgen 染色仍然為DNA 圖像分析系統的標準染色方法， 其機制是細胞DNA 中脫氧核糖與嘌呤之間的糖苷鍵經鹽酸水解后斷裂，脫氧核糖一端離醛暴露，并且與染色液中硫堇和亞硫酸根的中間產物相互作用形成藍紫色化合物。 改良Feulgen 染色法是采用硫堇試劑冷配法、高濃度鹽酸高溫下一步水解法，結果呈藍色，使DNA 染色效果達到了檢測標準，克服了經典Feulgen 染色時間長達4 h 的缺點，縮短到30 min，大大提高了工作效率，并借此可以拓展細胞DNA 檢測的應用范圍。

圖2 同一標本各組染色直方圖及散點圖對比

表1 兩種染色方法宮頸標本二倍體細胞核IOD、DI、CV 值的情況

表2 兩種染色方法對標準片細胞核IOD、DI、CV 值的情況

在印片、冷凍切片、石蠟切片及液基制片中細胞DNA 染色中， 對經典Feulgen 染色技術進行改良，在國內外均為有一定的嘗試和報道［4，5］，該文應用改良Feulgen 染色法進行宮頸癌普查檢測樣本液基細胞進行染色，獲得了與傳統方法相同且滿意的結果，細胞核染色深，結構清晰，背景著色淡，而所需染色時間則大大縮短，每批標本染色總共所耗的時間由常規染色的4 h 縮短到30 min； 圖像分析檢測顯示，應用改良Feulgen 方法染色結果，與傳統方法結果基本相符，而且有較好的重復性。

DNA 染色的成敗關鍵在于酸解，酸解不充分將致Feulgen 反應減弱，過度則呈陰性結果，而酸解時間與溫度對其結果影響為最大［6］。 該文采用了升溫酸解的方法，不僅確保了酸解的穩定性，而且還避免了長時間固定和酸解造成制片脫落的不良現象，在染色過程中，應該嚴格把握酸解時間［7］。在常規脫落細胞學單憑細胞形態判斷良惡性遇到困難時，細胞DNA 倍體分析可提供重要參考數據， 經典Feulgen 染色法耗時長， 改良Feulgen 染色法的應用，大大縮短了染色時間，且效果穩定，滿足了快速診斷的要求。筆者認為，改良Feulgen 染色法與經典Feulgen 染色法對檢測細胞DNA 結果高度一致，將改良Feulgen 染色法檢測DNA 含量分析方法在臨床疾病的輔助診斷，時間短、穩定性好，提高了工作效率，值得應用與推廣。