榆林沙區引種波爾卡樹莓的組織培養與快速繁殖

王建新，吳志茹，馮光惠

（1.榆林市林業工作站，陜西榆林719000；2.榆林學院生命科學學院，陜西榆林719000）

樹莓（Rubus idaeus L.）俗稱覆盆子，是薔薇科懸鉤子屬（Rubus L.）植物，為多年生落葉灌木果樹。樹莓果實營養價值高、口感好，果實中除含有豐富的糖類、氨基酸、纖維素外，還有糅化酸、SOD 酶、類黃酮等對人體具有保健作用的成分。樹莓的根莖葉在醫藥、化妝、保健、食品、加工等方面都有著廣泛的用途。樹莓生長快、耐瘠薄、耐干旱，是優良的水土保持植物[1]。樹莓與沙棘、枸杞并列為北方三大水土保持先鋒植物，并逐漸向產業化方向發展[2-4]。近年來，樹莓的國內外市場需求不斷增加，果實價格持續上漲，東北地區和內蒙古等北方優生地人為采摘果實現象普遍，養護管理措施相對滯后，野生種質資源破壞嚴重，優勢野生種源地不斷減少，優質果實產量相對降低[5-6]。因此，拓展和引進樹莓優質種質資源，在適生地開展樹莓新品種的栽培和利用具有十分重要的意義。

榆林市林業站近年從東北地區引進多個紅樹莓品種，在榆林沙區經過5～6 a 的馴化栽培，生長勢良好，抗寒、抗旱、抗病蟲害和耐鹽堿等適應能力均很強，但不同品種結果能力有差異，其中，波爾卡口感好，味道美，結果性狀好。傳統的繁殖方法是靠根蘗、扦插、壓條進行，繁殖系數低，苗木質量差，不利于規模化生產的需要[7-8]。利用植物組織培養技術生產樹莓苗木，不僅能保持母株的優良特性，同時可提高繁殖系數和苗木質量。

本研究以榆林沙區引種成功且結果性狀優良的樹莓品種波爾卡為試材，以春季新梢幼嫩莖段和莖尖為外植體，通過組培方法研究不同培養基上外植體的生長狀況，探索樹莓的組織培養和快速繁殖體系，以期為榆林沙區引種樹莓的產業化育苗提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料是2017 年春季從東北地區引進的2 年生樹莓新品種波爾卡，在榆林沙區經過2 a 的引種栽培和田間試驗，生長勢良好。2019 年4 月于引種基地采集1 年生枝條上萌發的幼嫩新梢，裝于保濕透氣塑料袋帶回實驗室進行處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的滅菌 剪去幼嫩新梢上的葉片并剪成4～5 cm 長帶1～2 個芽的莖段，每次試驗剪15～20 個莖段，用1%的吐溫-80 浸泡10～15 min，自來水下沖洗0.5～1.0 h，備用。在超凈工作臺上，將外植體材料轉入無菌燒杯中，用75%的酒精浸泡約30 s，無菌水漂洗2 次，再用0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒，消毒時間設置為4，6，8，10，12 min，每隔2 min 用玻璃棒攪拌1 次，使漂浮在液面上方的材料能夠充分接觸消毒液，無菌水漂洗5 次，分裝于無菌培養瓶。每瓶接種1 個外植體，不同消毒時間均接種40 瓶，統計不同消毒時間的污染率和對外植體的傷害程度。

1.2.2 外植體的接種與培養

1.2.2.1 初代誘導培養 用無菌濾紙吸取外植體上的多余水分，將外植體切成大約1 cm 長帶1 個腋芽或頂芽的莖段，接種在以MS 為基本培養基附加不同質量濃度激素配比（6-BA 分別為0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L，NAA 分別為0.05，0.10，0.20 mg/L）的12 種誘導培養基上，每種培養基接種40 個腋芽和10 個頂芽。為降低污染率，每瓶接種2 個外植體。暗培養7 d 后轉為25 ℃光照培養16 h。研究不同培養基對愈傷組織誘導的影響，30 d 后統計愈傷組織誘導率以及側芽和頂芽的萌發率。

1.2.2.2 繼代增殖培養 取已萌發1～2 cm 的單芽或切割叢生芽為單芽，接種在含不同質量濃度激素配比（6-BA 分別為1.0，1.5，2.0 mg/L，NAA 分別為0.01，0.02，0.05 mg/L）的9 種增殖培養基上，每瓶接種2 個單芽，每種培養基接種10 瓶。25 ℃光照培養16 h，觀察記錄生長情況，統計不同培養基對單芽增殖的影響，30 d 后計算平均增殖系數。

1.2.2.3 生根培養 取3～4 cm 長的單株苗，分別接種于MS、1/2 MS、1/3 MS 添加不同質量濃度IBA（0.1，0.2，0.5 mg/L）的9 種生根培養基中，每瓶接種2 個單株苗，每種培養基接種20 瓶。研究不同培養基對樹莓組培苗生根的影響，30 d 后統計生根率及根系生長狀況。

1.2.3 組培苗的馴化移栽 組培苗的馴化移栽是植物組培快繁的重要環節，需要從無菌向有菌、高溫向變溫、高濕向低濕、弱光向強光等環境因素轉變。選用冀菲等[9]研究黑果枸杞組培苗馴化移栽的基質，前期7 d 的煉苗階段與培養室環境相似，遮陰降低光照強度，噴灑自來水保濕且降低溫度，相對濕度為85%～90%；后期馴化階段與室外環境相近，逐漸增加自然光照。

2 結果與分析

2.1 消毒時間對外植體污染率的影響

由表1 可知，先用75%的酒精對外植體消毒30 s，再用0.1%的HgCl2溶液消毒8 min 效果最好，污染率為7.5%，外植體顏色未發生變化；滅菌10 min的污染率仍為7.5%，但外植體顏色較消毒8 min變深，有褐變現象，受傷害程度較大；滅菌12 min的污染率為0，受傷害程度嚴重，嚴重影響外植體活性，會導致愈傷組織誘導率和成苗率降低。

表1 滅菌時間對外植體污染率的影響

2.2 不同培養基對愈傷組織誘導率及芽萌發的影響

外植體接種到培養基上，對于不易形成不定根的植物，需通過誘導的愈傷組織吸收養分和水分。以MS 為基本培養基，將無菌外植體莖段和莖尖接種于添加不同濃度激素配比的誘導培養基中，暗培養7 d 后，在外植體切口處出現白色的愈傷組織，呈松散的不規則瘤狀；轉為光照培養，愈傷組織顏色由白逐漸變綠，膨大突起，逐漸增殖變大變松散。30 d 后在愈傷組織表面觀察到綠色的不定芽，同時莖段側芽和頂芽萌發變長。從表2 可以看出，不同激素配比對愈傷組織誘導的影響差異較大，在細胞分裂素6-BA 濃度一定時，隨著生長素NAA 濃度的升高，愈傷組織的誘導率相應升高，其中，在4 種6-BA 濃度中，當6-BA 質量濃度為1.0 mg/L 時，相應誘導率均最高；在生長素NAA 濃度一定的情況下，隨著6-BA 濃度的升高，愈傷組織誘導率變化不大，其中，當NAA 質量濃度為0.2 mg/L 時，相應誘導率均最高。在愈傷組織形成不定芽的同時，頂芽和側芽均能夠萌發，但二者的萌發率不同，統計12 種培養基中所有側芽（480 個）和頂芽（120 個）外植體的萌發情況發現，側芽的萌發率為80%，且在不同培養基中的生長勢差異較大；頂芽的萌發率為100%，且生長健壯，整齊一致。因此，最適合樹莓外植體愈傷組織誘導的培養基是MS＋6-BA1.0 mg/L＋NAA 0.20 mg/L，誘導率為96%，選取頂芽為外植體更合適。

表2 不同培養基對樹莓外植體愈傷組織誘導率的影響

2.3 不同培養基對芽增殖的影響

取1～2 cm 生長健壯攜帶少量愈傷組織的單株苗，接種在含不同濃度激素配比的增殖培養基上，培養7 d 后，單株苗基部愈傷組織開始變大變綠，之后逐漸增大并再次分化出叢生不定芽，30 d 后統計平均增殖系數發現，不同培養基誘導分化叢生芽的能力不同，平均增殖系數不同，叢生芽的生長勢差異較大。在6-BA 濃度一定時，隨著生長素NAA濃度的升高，不定芽總數相應升高，但是，在3 種6-BA 濃度中，當6-BA 質量濃度為1.5 mg/L 時，相應不定芽總數均最高；在生長素NAA 濃度一定時，當6-BA 質量濃度為1.5 mg/L 時，不定芽誘導率均最高。所以，最適樹莓不定芽增殖的培養基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L，平均增殖系數為9.70，玻璃化現象較輕，叢生芽生長健壯（表3）。

表3 不同培養基對不定芽增殖的影響

2.4 不同培養基對組培苗生根的影響

表4 不同培養基對組培苗生根的影響

取3～4 cm的健壯單株，分別接種于MS、1/2 MS、1/3 MS 添加不同濃度IBA 的生根培養基中，7 d 后組培苗基部愈傷組織膨大并生長出白色根尖，14 d后根生長速度加快，在主根上萌發出側根。30 d 后統計發現，不同培養基及IBA 濃度對樹莓組培苗生根的影響不同，生根速度及生根率差異明顯，在基本培養基一定時，隨著IBA 濃度的升高，生根率均相應升高，其中，1/2 MS 基本培養基的生根率均最高；在IBA 濃度一定時，1/2 MS 基本培養基的生根率也是最高的，且根系生長均正常。所以，最適組培苗的生根培養基為1/2 MS＋IBA 0.5 mg/L，生根率達97.5%，且主根比較健壯，側根數量多，植株生長旺盛（表4）。

2.5 組培苗的馴化移栽

生根培養30 d，選擇根系生長健壯、發育良好的組培苗，洗掉根部培養基，剪掉過多須根，僅留主根和部分側根，將幼苗移入熏蒸消毒基質中，發現泥炭土、蛭石、珍珠巖（體積比為2∶1∶1）營養基質更適合組培苗的生長。經過統計，移栽50 株，成活44 株，成活率高達88%，植株生長健壯，與野生紅樹莓的外部形態特征相似度高。

3 結論與討論

本試驗結果表明，榆林沙區引種波爾卡樹莓的外植體最佳采集時間為4 月下旬，生長活性強，褐變現象較輕；最適外植體材料為新梢頂芽，不僅易誘導形成愈傷組織，而且萌發率高；用HgCl2消毒最佳時間為8 min，最適樹莓愈傷組織誘導的培養基為MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.20 mg/L，最適樹莓不定芽增殖的培養基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L，平均增殖系數為9.7，最適組培苗的生根培養基為1/2 MS＋IBA 0.5 mg/L，生根率達97.5%，且生長勢良好，植株健壯。本研究體系能在較短時間內獲得數量多且遺傳性狀穩定的優質樹莓組培苗，對推動榆林沙區樹莓產業化發展具有重要意義。

在植物組織培養試驗過程中，出現污染是普遍現象，其中，外植體接種污染是主要原因，導致試驗無法達到預期效果。用0.1%HgCl2溶液滅菌效果要好于10%的NaClO 溶液，但前者一旦污染對人傷害較大，操作要特別小心細致。消毒時間適宜控制在8 min 左右，易雙雙等[10]、林樹燕等[11]有相似報道。在外植體消毒、接種過程中，要嚴格按照實驗規程操作，接種過程中要隨時用75%酒精擦拭雙手和臺面，以減少污染的發生。

在木本植物的組培過程中，易出現褐變現象。褐變是由于植物組織中酚類物質被多酚氧化酶（PPO）氧化后產生醌類物質，逐漸擴散到培養基中并累積起來，抑制細胞中其他酶的活性，毒害培養的外植體材料。在接種前預冷外植體、初代培養前期暗培養、縮短轉瓶周期均可抑制褐化現象，李小艷等[12]在黑枸杞組織培養中得出類似的研究結果。外植體取材時間也是影響褐化的重要因素，在榆林沙區最適外植體取材時間是4 月下旬，可能是由于該時期幼嫩莖段部位酚類化合物含量低或多酚氧化酶活性低的原因。

在樹莓初代誘導培養中，多數學者以帶芽莖段和莖尖為外植體，MS 為基本培養基，并附加不同濃度配比的細胞分裂素和生長素。二者的濃度及比值決定細胞分化的方向，由于所用激素藥品的效用不盡相同，采用的激素梯度和配比設計方法不同，導致最終得出的最適培養基配方有一定差異。本研究與畢海林等[13]研究的秋福樹莓組織培養相比，所用6-BA 濃度偏小，NAA 濃度相同；與孟靜靜等[14]研究的黑樹莓組培相比，6-BA 和NAA 濃度均偏大，但比值相近，原因有待進一步驗證。

在樹莓不定芽的繼代增殖培養中，因選取的不定芽大小不同、不定芽是否攜帶愈傷組織以及統計的不定芽大小與時間不同而導致得出的增殖系數均有所差異。本研究選取1～2 cm 帶部分愈傷組織的不定芽，得出最適增殖培養基的6-BA、NAA 質量濃度與國內學者[15-17]的研究結果基本一致，即6-BA質量濃度為0.5～2.0 mg/L、NAA 質量濃度多為0.05～0.20 mg/L。在統計不定芽的增殖系數時，衡量芽大小的指標不確定，增殖系數有差異。同一培養基，相同長度的芽，生長過程中的增殖程度也不同，可能是由內部生理生化代謝及培養環境的細微差異導致。另外，培養溫度、光照時間等環境因素也是影響增殖系數的因素，仍需進一步深入細致地研究。

生根是木本植物獲得健壯組培苗的關鍵，合適的生長素及濃度是誘導生根的重點。在木本植物組培苗的生根試驗中，多數學者選用的生長素是NAA與IBA，有二者混合使用[18-19]，也有NAA[20]或IBA[21]單獨使用。本試驗通過對比得出，單獨使用IBA 生根率高，添加NAA 不能有效提高生根率，可能是由于樹莓組培苗在增殖培養過程中自身體內合成了較多NAA 的緣故。

馴化移栽是植物組培苗發生質的改變的一個階段，需要從無菌向有菌過渡，溫度、濕度、光照等因子都會發生變化。關于樹莓馴化移栽的文獻報道較少，冀菲等[9]研究了黑果枸杞組培苗馴化移栽的基質，移栽成活率高；而本研究采用與黑果枸杞相同的基質配方，移栽成活率略低，也低于不同基質配方的樹莓移栽成活率[22]，可能與樹莓不同品種特性及環境的微控有關，仍需深入研究波爾卡樹莓品種的生理生化特性，優化馴化移栽的關鍵環境因子，不斷提高移栽成活率，從而能為波爾卡樹莓組培苗的工廠化移栽提供技術保障。