糧食中主要真菌毒素危害及聯合毒性研究進展

袁 航

(無錫城市職業技術學院，江蘇 無錫 214153)

真菌毒素是由絲狀真菌次級代謝產生的小分子量天然產物，污染糧食現象在全球范圍內極為普遍。聯合國糧食與農業組織(FAO)估計全球糧食受真菌毒素污染的比例約為25%，近年來研究人員通過對歐洲食品安全局和全球大調查的約50萬份分析數據也證實了這一比例[1]。真菌毒素通常難以降解，能在廣泛的pH范圍內存在，通過飲食或飼料，進入人和動物體內并發揮其毒性作用，對人和動物的健康形成一系列不良影響[2]。真菌在農產品貯藏期間大量繁殖，導致毒素濃度在貯藏期間大幅度增加，而毒素濃度較高的農產品可能被人類或動物攝入。真菌毒素被人類攝入后，會對人類產生強烈的致癌、致畸與致突變的作用，如黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)主要與肝癌的發生有關，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)具有很高的細胞毒性和免疫抑制性質，通常會引起人類急性中毒，嘔吐、腹瀉等較為普遍。AFs和DON的化學結構式如圖1所示。

AFs主要是黃曲霉和寄生曲霉產生的次生代謝產物，大部分是二氫呋喃香豆素的衍生物，其化學結構類似。AFs主要有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1和AFG2)4種類型，而AFM1和AFM2是由AFB1和AFB2經代謝后產生的。AFs主要污染糧油類食品，在溫濕度較高的區域食品和飼料中出現幾率最高，其中大部分谷物都發現過這類毒素。AFs主要能引發人和動物的肝部損傷，具有致突變和DNA損傷的作用，其中AFB1毒性是砒霜的68倍，氰化鉀的10倍，對動物肝臟有嚴重破壞作用，可導致急性肝炎、肝癌甚至死亡[3-4]。

DON一般是由生長在小麥、玉米等植株上的鐮刀菌產生的次級代謝產物構成，是一種單端孢霉烯族毒素。該毒素能夠引發人與動物嘔吐，所以又稱嘔吐毒素[5]。自DON被發現以來，已有大量研究[6-8]報道，其對人體和動物均有顯著的急性和潛在的慢性毒作用。目前有研究[9]發現，DON具有一定的多代毒性，可通過被污染的懷孕母體傳遞給子代，并對其產生不良影響。

AFs和DON等在糧食中經常發現，并且不同類型毒素經常共同存在，而其共存后對人體的聯合毒性尚缺乏系統的認識，僅有少部分學者對毒素共存狀態下的毒性進行了研究。如有研究人員[10]測量了AFB1、DON和玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)的單獨、二元和三元組合對HepG2細胞和RAW 264.7的細胞活力和細胞擾動的影響，表明真菌毒素聯合作用顯著增加了細胞內ROS的產生和[Ca2+]電通量，并降低了兩種細胞系的膜電位(MMP)。HepG2細胞具有活性氧(ROS)產生的主要酶系，以及肝細胞代謝酶[11]，能形成較穩定的細胞系，有利于研究的連續性，能保證其研究對象的一致性以及試驗準確性，所以真菌毒素的聯合毒性常采用HepG2細胞作為研究對象。文章擬綜述近年來國內外有關以上主要真菌毒素對糧食的危害以及對人體細胞產生的毒性作用，旨在對未來預測和預防真菌毒素對人和動物健康影響提供文獻依據。

圖1 AFB1與DON化學結構式

1 糧食中的真菌毒素及其危害

1.1 影響真菌毒素產生的條件與因素

AFs主要是黃曲霉和寄生曲霉產生的有毒代謝產物。在自然界，黃曲霉的生長要求不高，在有氧條件下，玉米和花生是最好的繁殖場所，因而AFs污染的幾率較大[12]。在AFs產生的過程中，溫度是一個很重要的條件，溫度的高低會影響真菌毒素產生速度以及數量。在25～30 ℃下，相對濕度80%～90%，曲霉屬真菌易產生真菌毒素[13]。在眾多的糧食及飼料發生真菌毒素污染的地區來看，普遍南方高于北方，因為南方地區溫暖潮濕，利于真菌的生長繁殖。同時，在貯藏前期，糧食的水分含量如果控制不好，也容易發生真菌毒素的污染。谷物類如果經過粉碎，粉末容易吸收周圍環境中水分，貯藏時更容易受到霉菌污染[14]。

DON最先由一株患有赤霉病的大麥中分離得到，產生于禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌[15]。糧食谷物類食品受DON污染主要與產毒菌株種類、溫濕度以及通風日照等因素有關。產生DON的鐮刀菌大多在溫度較低，濕度較高以及通風不良的環境中慢慢生長，從而產生濃度較高的真菌毒素。同時，在收儲后期，如果糧食谷物的水分含量控制不好，未經充分干燥，也容易滋生鐮刀菌。若庫存過多以及堆壓時間過長，均會為鐮刀菌的生長提供有利的條件，從而被污染。

1.2 真菌毒素危害

真菌植物病原體產生的次生代謝產物具有較大的毒性作用，對糧食安全構成重大威脅，限制了全球糧食供應的市場化。雖然目前已經鑒定出數百種真菌毒素，但已知影響全球農業的真菌毒素相對較少，而AFs和DON對谷物品質和糧食安全具有重大影響[16]。食品安全問題與人們的身體健康和生命安全直接相關，在居民生活中占據了極為重要的地位。而真菌毒素對于糧食安全的危害極大，如DON具有多代毒性，不僅對當代人的生命安全造成影響，并且對下一代也影響深遠[17]。

谷物類食品儲藏條件不當時，容易受到真菌污染產生毒素，嚴重影響糧食及飼料的經濟價值和品質。在谷物生長、收獲、運輸和加工等環節，真菌毒素均會產生危害。人和動物攝入或皮膚接觸這些被AFs污染的糧食和飼料，會引發多種中毒癥狀甚至死亡[18]。同時，真菌毒素被人或動物攝入之后，不易排出體外，容易在體內富集產生較大毒性從而危害人與動物的健康。目前，糧食和飼料中真菌毒素污染的狀況頻頻發生，對糧食和飼料中真菌毒素的污染情況進行監控，確保糧食和飼料的質量安全至關重要。安徽省淮北地區在2010～2014年，419份樣品中AFB1檢出率為29.8%，超標率0.7%；926份樣品中，有145份樣品檢出ZEN，超標率2.7%[19]。由于中國大部分地區氣候溫和，濕度較大，適宜真菌生長代謝，因而糧食受真菌毒素污染較為普遍。糧食有害微生物鐮刀菌屬在收儲前期產生較多，而中后期主要是以黃曲霉、寄生曲霉為主和以青霉為主[20]。DON是谷物赤霉病的重要指示性毒素，大量存在于小麥、玉米中，對糧食安全造成巨大影響，引發極大經濟損失[21]。

2 糧食中真菌毒素間聯合毒性

2.1 AFB1與其他毒素聯合毒性

AFB1已被國際癌癥研究機構明確為I類致癌物，全球大約4.6%～28.2%的肝癌由AFB1攝入引起[22]。近幾年，國內外研究者對真菌毒素間聯合作用有不同的研究，其中AFB1的研究較為普遍[23-25]。

2.1.1 AFB1與DON 近年來，Ricordy等[23]研究了AFB1對3種人細胞系(HepG2，SK-N-MC和SK-N-SH)細胞周期進程的影響，顯示AFB1致癌作用與其跟DNA形成不穩定加合物的能力有關，毒素處理導致的細胞周期進展顯著改變，AFB1影響DNA合成時p53基因的表達。Shi等[26]研究表明，AFB1在肝線粒體呼吸鏈復合物I-IV活性中顯著誘導肝線粒體功能障礙。

李文竹等[27]研究AFB1與DON兩種毒素單獨及混合作用于HepG2細胞/C3A細胞，細胞增殖抑制率明顯增加，雙鏈DNA含量降低，經分析后發現兩者作用類型為加和作用。兩種毒素低濃度作用下均能引起細胞發生凋亡，使得細胞周期前期(S期、G2/M期)停滯生長，并且引起caspase-3和Bax表達量增加，Bcl-2則下降，從而引發細胞凋亡。RNA-Seq測序結果顯示，AFB1與DON的毒性作用機理并不相同，其中AFB1以及兩者的混合作用主要是通過p53部位信號通路變化影響細胞凋亡，與Ricordy等[23]研究結果相同。DON主要影響核糖體循環這條通路，阻止蛋白質合成，對細胞有一定的毒性作用。AFB1與DON主要是通過2種不同的途徑，即p53信號通路以及核糖體循環通路共同導致細胞凋亡的發生。兩種真菌毒素盡管途徑不同，結果都是干擾細胞蛋白質的合成，抑制其正常生理活動，影響細胞代謝，引發細胞毒性作用。

2.1.2 AFB1與伏馬毒素 伏馬毒素(Fumonisin，FB)是一組真菌毒素，主要來源于鐮刀菌，伏馬毒素B1(Fumonisin B1，FB1)，伏馬毒素B2(Fumonisin B2，FB2)和伏馬毒素B3(Fumonisin B3，FB3)是其常見的3種類型，其中FB1是其主要組分。FB1是溶于水的真菌毒素，對熱穩定，不容易被蒸煮破壞結構[28-29]。杜明等[30]研究了AFB1和FB1的聯合毒性，發現其相互作用為加和作用。隨著毒素濃度的增加，HepG2細胞的ATP或DNA含量逐漸較少。同時，聚類分析顯示，對于混合與單獨染毒組，ATP、DNA、活性氧(ROS)、線粒體膜電位(MMP)4個指標中，DNA相比于ATP、ROS、MMP 3種指標較為獨立，而后三者有一定的聯系。有研究[31]發現，在細胞凋亡時，ATP水平的下降和線粒體膜電位下降同時發生，且線粒體是ROS產生的主要場所，又是ROS作用最敏感的部位，ROS通過氧化線粒體心磷脂，線粒體DNA和其重要的蛋白質對線粒體造成氧化損傷，進而誘導細胞凋亡。ATP以及ROS等指標的下降，在轉錄及翻譯水平上均對蛋白質生物合成造成抑制作用，進而影響細胞代謝，產生毒性作用。

2.1.3 AFB1與雜色曲霉毒素 雜色曲霉毒素(Sterigmatocystin，ST)是一類結構類似的化合物，主要是雜色曲霉和構巢曲霉的最終代謝產物，同時以中間產物的形式存在于合成AFs的過程中[32]。劉洋[33]研究了AFB1和ST單獨及聯合染毒時對HepG2細胞的毒性作用，結果顯示AFB1、ST及其混合物都誘導HepG2細胞發生了細胞周期阻滯，聯合作用時則同時誘導HepG2細胞發生G0/G1期阻滯和S期阻滯。采用細胞免疫組織化學染色檢測AFB1、ST單獨及聯合作用效果，結果表明Bcl-2蛋白的陽性表達量呈劑量依賴性降低，Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及p53的陽性表達量隨著毒素濃度的增加而增加。因而AFB1和ST聯合作用于HepG2細胞時為加和作用，兩者會對HepG2細胞的主要部位如DNA和線粒體造成損傷，并且引起細胞凋亡。

2.1.4 毒素種類對HepG2細胞毒性影響 Theumer等[34]在研究AFs及其前體在人體細胞中的遺傳毒性時，發現在研究的3種細胞系中最具遺傳毒性的化學物質依次為雜色曲霉毒素(ST)、AFB1、AFB2、AFG1和雜色曲霉毒素A(VERA)。然而無論測試的細胞系如何，AFB2和AFG2都不具有細胞毒性和基因毒性。

2.2 DON與其他毒素聯合毒性

歐盟分類標準中，DON為三級致癌物。人和動物如果長期攝入DON可抑制體內蛋白質的合成，對機體有一定的危害作用，會造成嘔吐、腹瀉、厭食、惡心、神經紊亂等毒性效應[6-8]。近年來，研究學者在真菌毒素對細胞系的研究方面除了AFs，DON的研究也較為廣泛。

2.2.1 DON與ZEN ZEN又稱F2毒素，是真菌的次級代謝產物，主要由鐮孢屬菌種產生。一項關于農業和動物中真菌毒素含量的調查報告顯示[35]，在東南亞、南歐和北美的AFB1/DON/ZEN的檢出率分別為65%/41%/49%、50%/41%/19%和8%/87%/52%。周鴻媛等[9]測量了AFB1、DON和ZEN的單個、二元和三級組合對HepG2細胞的細胞活力和細胞擾動的影響，結果顯示不同濃度的真菌毒素的不同組合顯示出不同類型的相互作用。大多數混合物如DON與ZEN顯示出協同作用，而AFB1-ZEN的組合觀察到拮抗作用。研究過程中真菌毒素的組合顯示細胞內ROS產生和[Ca2+]電通量顯著增加，并且兩種細胞系中MMP均降低，表明真菌毒素組合的協同和累加效應源于多種細胞功能的擾動。邱思奇等[36]研究表明，DON和ZEN對HepG2細胞具有顯著的促增殖和促細胞遷移的作用，在HepG2細胞系上具有潛在的致癌性。DON與ZEN均屬于單端孢霉烯族毒素，兩種毒素同時存在時，毒性明顯呈加和作用。

2.2.2 DON與展青霉素和T-2毒素 展青霉素(Patulin，PAT)主要由青霉屬、曲霉屬和絲衣霉屬等菌種代謝產生[37]。PAT在霉爛蘋果和蘋果汁中較為常見，在各種霉變水果以及青貯飼料中廣泛存在。在細胞水平上，PAT產生細胞膜破壞、蛋白質合成的抑制、轉錄和翻譯的破壞以及DNA合成的抑制以及其他作用[38]。

T-2毒素(T-2)是由大多數鐮刀菌產生的一種真菌毒素。主要污染小麥、大麥、玉米等糧食作物及其制品，危害性較大。在細胞水平上，T-2與核糖體結合會抑制蛋白質、RNA和DNA的合成[39]。

Fernandez-Blanco等[40]研究表明，與單獨使用DON、T-2、PAT 3種霉菌毒素產生的細胞毒性作用相比，食物中這3種霉菌毒素的共存可能會增加其細胞毒性作用。

2.2.3 不同DON形式對HepG2細胞毒性 交鏈孢菌酚(Altemariol，AOH)是由幾種鏈格孢屬菌種產生的真菌毒素之一，最常見的是交替孢子。毒素3-乙酰基-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-ADON)和15-乙酰基-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-ADON)是由禾谷鐮刀菌產生的DON的乙酰化形式。Juan-Garcia等[41]在研究中，通過使用MIT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-酮])測定和評價HepG2細胞與AOH、3-ADON 和15-ADON的二元和三元組合處理的毒性作用。結果顯示3-ADON和15-ADON的組合對于增殖HepG2細胞比對其他任何組合的毒性更大，在所有組合中測到的主要效果是協同作用。

深氧—脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DOM-1)是由微生物對DON生物轉化的產物之一[42]。Mayer等[43]研究發現DON和DOM-1均可降低HepG2細胞的白蛋白分泌，但DOM-1的濃度要高得多；同時DON還對白細胞介素和一氧化氮產生影響。DON還能夠降低細胞活力，并在培養的任何時候對膜，染色體或DNA造成損害[6]。

3 展望

食品安全是國家戰略。根據教育部思政課程建設工作要求，在思政教學過程中要深度融入黨和國家高度關注的民生問題和國際視野下的熱點問題，增強學生的知識素養、民生意識、法制意識與國家安全意識，培養學生構建大思政格局。

糧食安全是食品安全的基本，也是國家和政治安全的保障，更是社會和諧穩定的條件。真菌毒素廣泛存在于糧食及其制品中，大多毒素均會被人和動物經口攝入，因此為更合理確保人和動物健康安全，在實際農產品和食品限量制定和防控監管過程中，適當考慮毒素暴露的風險具有一定意義。在糧食收獲及儲運過程中，應嚴格把控各個階段可能造成的真菌毒素污染，盡力將污染程度降至最低。糧食中的AFs和DON，其對細胞的單一及聯合毒性盡管通路不同，但其均是通過抑制細胞蛋白質的合成來影響細胞代謝。完善的細胞模型，可以幫助人們更好地了解真菌毒素對人體的毒性作用，HepG2細胞具有活性氧(ROS)產生的主要酶系，能保證研究對象的一致性以及試驗準確性，后續應進一步完善模型。后期可通過多種毒理學機理研究手段，擴展不同細胞系如Caco-2 細胞模型，對糧食中多種毒素聯合作用可能存在的致癌性進行全面評估，為相關真菌毒素的毒理學研究提供支撐，全面了解其對人和動物的毒性特別是致癌、致畸和致突變性，對于預測和預防真菌毒素對人和動物健康的影響意義重大。