植物乳桿菌和戊糖片球菌復合發酵牦牛肉工藝優化

陳一萌 唐善虎 李思寧 貢佳欣 李琦

摘 ?要：酸化對鮮肉有一定的嫩化作用，利用植物乳桿菌和戊糖片球菌2 種益生菌復合發酵可以改善牦牛肉的嫩度。采用單因素試驗和L9（34）正交試驗設計，以pH值、剪切力和可溶性蛋白含量為評價指標，優化植物乳桿菌和戊糖片球菌復合發酵牦牛肉的工藝參數。結果表明：最佳工藝參數為發酵劑接種量1.0×106 CFU/g、發酵溫度30 ℃、發酵時間18 h，在此條件下牦牛肉的pH值為5.02，剪切力為76.76 N，可溶性蛋白含量為52.02 mg/g。植物乳桿菌和戊糖片球菌復合發酵使牦牛肉的pH值降低，剪切力下降，可溶性蛋白含量增加，牦牛肉的嫩度得到一定程度的改善。

關鍵詞：植物乳桿菌;戊糖片球菌;牦牛肉;發酵;嫩化

Abstract： Acidification can tenderize fresh meat. In this study， two probiotic strains， Lactobacillus plantarum and Pediococcus pentosaceus were tested for use in mixed culture fermentation of yak meat for improved tenderness. One-factor-at-a-time method and an L9 （34） orthogonal array design were used to optimize the fermentation conditions based on pH， shear force and soluble protein content. The optimal fermentation conditions were obtained as follows： inoculum size 1.0 × 106 CFU/g， fermentation temperature 30 ℃ and fermentation time 18 h. The pH， shear force and soluble protein content of yak meat fermented under the optimized conditions were 5.02， 76.76 N and 52.02 mg/g， respectively. The decreased pH and shear force and the increased soluble protein content of fermented yak meat implied improved tenderness.?

Keywords： Lactobacillus plantarum; Pediococcus pentosaceus; yak meat; fermentation; tenderness

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190902-205

中圖分類號：TS251.5 ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：

牦牛是一種生長在海拔3 000 m以上高寒缺氧地帶的特有物種，能夠適應高原惡劣環境，享有“高原之舟”的美譽[1]。特殊的生活環境使牦牛肉肉質鮮美，同時具有高蛋白、低脂肪、低熱量、氨基酸種類與胡蘿卜素含量豐富等特點[2]。牦牛生長的獨特地理環境賦予牦牛肉得天獨厚的品質，但因其屠宰時年齡較大，導致牦牛肉肉質比普通牛肉嫩度差，從而使牦牛肉產品的開發和牦牛產業化發展受到一定影響[3]。肉的食用品質和化學組成會隨著動物年齡的增長而改變，年齡因素引起的嫩度差異可能與動物成熟過程中肌肉組織結構和化學組成，特別是結締組織的變化有關。嫩度一般用剪切力來表示，可溶性蛋白含量、剪切力和纖維直徑等與肉的嫩度呈強相關性。Mills等[4]將剪切力小于3.0 kg、3.0～4.6 kg和大于4.6 kg的牛肉分別定義為嫩牛肉、中等嫩度牛肉和低嫩度牛肉。徐瑛等[5]研究發現，3 歲齡以下的牦牛肉（剪切力3.59 kg）屬于中等嫩度肉，3 歲齡以上的牦牛肉均屬于低嫩度牛肉。楊玉瑩等[6]研究表明，同一年齡段的黃牛肉嫩度較好，其次為水牛肉，而牦牛肉嫩度最差。嫩度是決定牦牛肉食品品質的重要因素，也是制約其市場競爭力的主要因素。對于加工者而言，牛肉原料的嫩度決定了最終產品的檔次與價值，因此需要運用科學的手段對牦牛肉進行嫩化，改善其食用品質，使產品進一步增值。

肉的嫩度主要由肌原纖維和結締組織2 個因素決定。在屠宰和酮體冷卻成熟過程中，由于肌肉發生一系列變化，結締組織結構松散，肌原纖維發生斷裂，使肌肉變得柔軟鮮嫩，適口性得到改善[7]。肌原纖維直徑越小，肌節長度越大，肉的嫩度越好[8];肉中結締組織含量越高，肉的嫩度越差[9]。目前，已報道的牦牛肉嫩化方法主要有電刺激嫩化法[10]、蛋白酶嫩化法[11]、無機鹽嫩化法[12]和有機酸嫩化法[13]等。大量研究表明，弱有機酸，如乳酸或醋酸能通過弱化肌原纖維和結締組織改善肉嫩度[14-16]。目前的研究集中在注射弱有機酸調節pH值嫩化牛肉，但是弱有機酸在肌肉中擴散較慢，浸漬周期長，效果不理想[17]。通過乳酸菌發酵也是產生大量乳酸的一個途徑，向牦牛肉中添加植物乳桿菌、戊糖片球菌等益生菌，利用菌種的發酵作用將糖類分解成乳酸，較低的pH值環境和由益生菌產生的蛋白酶能使肉中蛋白質降解，使肌肉結構蛋白完整性遭到破壞，從而改善肉的嫩度[18]。而目前有關植物乳桿菌和戊糖片球菌復合發酵對牦牛肉嫩度影響的研究報道極少。

本研究以新鮮牦牛肉為原料，選用植物乳桿菌和戊糖片球菌作為復合發酵劑，通過測定發酵后牦牛肉的pH值、蒸煮損失率、剪切力和可溶性蛋白含量，利用單因素試驗和L9（34）正交試驗優化牦牛肉的發酵工藝參數，改善牦牛肉的嫩度，為提高牦牛肉食用品質、利用現代食品發酵技術改善牦牛肉生產工藝提供一定的理論依據。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料與試劑

牦牛肉：隨機選取由四川省阿壩州紅原縣永源肉業提供的10 頭健康無病3 歲齡成年公牦牛，集中屠宰后現場采集背最長肌，于24 h內進行冷卻排酸處理后于-20 ℃下急速冷凍，0～4 ℃運輸至實驗室。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus） ? 中國工業微生物菌種保藏管理中心;MRS肉湯、MRS培養基 ? 杭州微生物試劑有限公司;牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） ? 上海如吉生物科技有限公司;NaCl、KCl、KH2PO4、K2HPO4、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）-2Na、MgCl2、NaOH、C4H4KNaO6·4H2O、CuSO4·5H2O、NaNO?、C6H12O6（均為分析純） ? 成都科龍化工試劑廠;食鹽（食品級） ? 成都市武侯區紅旗超市，。

1.2 ? 儀器與設備

DHP-9162D恒溫培養箱 ? 上海齊欣科學儀器有限公司;MP511 pH計 ? 上海三信儀表廠;Centrifuge 5804離心機 ? 德國Eppendorf公司;UV1810S紫外分光光度計 ? 上海佑科儀器表有限公司;TA-XT Plus質構儀 ? 英國Stable Micro Systems公司。

1.3 ? 方法

1.3.1 ? 菌種活化

將植物乳桿菌和戊糖片球菌菌種從-80 ℃冰箱中取出，加入MRS肉湯中，于30 ℃培養箱中恒溫培養24 h，重復此操作2 次，當培養基呈明顯混濁時，活化完成，保存于4 ℃冰箱。應用MRS培養基對活化好的菌種進行平板活菌計數。

1.3.2 ? 發酵牦牛肉制作工藝

原料肉→解凍、修整→清洗、切片→腌制→紫外殺菌40 min→接種發酵劑→發酵→密封袋包裝

菌種活化→母發酵劑→生產發酵劑

操作要點：將-20 ℃條件下冷凍的牦牛肉取出至4 ℃冰箱中進行解凍，剔除牦牛肉上的筋膜和可見脂肪塊后洗去血污，然后切成5 cm×3 cm×3 cm大小、形狀規整、厚薄均勻的肉條;置于含3 g/100 mL食鹽、5 mg/100 mL亞硝酸鈉的腌制液中，4 ℃腌制12 h;腌制完成后的肉條瀝干水分后，分組并稱質量，置于超凈工作臺紫外線照射40 min后，將活化好的植物乳桿菌和戊糖片球菌按1︰1的比例通過注射的方式接種到牦牛肉中;用保鮮膜封口，置于恒溫培養箱中發酵。

1.3.3 ? 單因素試驗設計

針對發酵劑添加量、發酵溫度和發酵時間開展單因素試驗，試驗設計為：1）選擇發酵劑添加量分別為0、0.5×106、1.0×106、1.5×106、2.0×106 CFU/g，在30 ℃條件下發酵24 h;2）發酵溫度分別為20、25、30、35、40 ℃，發酵劑添加量為1.0×106 CFU/g，發酵24 h;3）發酵劑添加量1.0×106 CFU/g，在30 ℃條件下分別發酵16、18、20、22、24 h。以pH值、蒸煮損失率和剪切力為指標，篩選適宜的發酵條件。

1.3.4 ? 正交試驗設計

以發酵劑添加量、發酵溫度和發酵時間作為3 個主要因素，依據單因素試驗結果確定正交試驗的因素水平，采用L9（34）正交表，進行3因素3水平的正交試驗，在正交表中增加空白列，以pH值、剪切力和可溶性蛋白含量為評定指標，重復進行3 次平行試驗，篩選出最優發酵工藝。L9（34）因素水平表如表1所示。

1.3.5 ? 指標測定

1.3.5.1 ? pH值測定

按照王德寶等[19]的方法，將肉樣充分絞碎，稱取3 g左右，加入27 mL蒸餾水，混合均勻后，靜置30 min，每次使用前先將pH計進行校正，將已校正的pH計插入樣品中，待讀數穩定后，記下讀數。每組樣品做3 個平行。

1.3.5.2 ? 蒸煮損失率測定

參考盧智等[20]的方法，并稍作修改。將嫩化好的牦牛肉切成均勻的長條，擦干表面水分并稱質量，放入蒸煮袋中，在95 ℃水浴鍋中加熱30 min，使牦牛肉中心溫度達到85 ℃，取出樣品，冷卻至常溫，用濾紙擦干表面水分，然后稱質量。每組樣品做3 個平行。

式中：m1表示蒸煮前肉質量/g;m2表示蒸煮后肉質量/g。

1.3.5.3 ? 剪切力測定

參考趙立等[21]的方法，并稍作修改。將嫩化后的牦牛肉于95 ℃水浴鍋中煮制30 min后，使牦牛肉中心溫度達到85 ℃，取出瀝干水分并冷卻至室溫，將肉樣切成2 cm×1 cm×1 cm的長條，用質構分析儀的HDP/BSW探頭測定肉樣剪切力，測前速率2.0 mm/s，測中速率2.0 mm/s，測后速率10.0 mm/s，下行距離30 mm，負載類型Auto-20g。每組樣品做3 個平行。

1.3.5.4 ? 可溶性蛋白含量測定

參考孔令明等[22]的方法。取肉樣4.00 g，切碎，加入40 mL提取液：含100 mmol/L KCl、20 mmol/L K3PO4（7 mmol/L KH2PO4、18 mmol/L K2HPO4）、1 mmol/L EDTA和1 mmol/L MgCl2，用HCl調至pH 7.0，4 ℃保存;用勻漿機搗碎均勻，將勻漿倒入50 mL離心管中，10 000 r/min離心15 min（0～4 ℃），將上清液倒入小燒杯中，用雙縮脲法測定可溶性蛋白含量。

可溶性蛋白含量測定參考王兆明[23]的雙縮脲法。用10 mg/mL的BSA標準溶液配制質量濃度分別為0、2、4、5、6、8、10 mg/mL的溶液各10 mL，然后取各質量濃度的BSA溶液1 mL于試管中，加入縮二脲試劑4 mL，25 ℃放置60 min，以空白試劑凋零，在540 nm波長處測定各BSA溶液的吸光度（A540 nm）。通過Microsoft Excel 2010中的回歸分析建立直線回歸方程：y=0.044x+0.002（R2=0.999 7），其中x為BSA質量濃度，y為相應樣品在540 nm波長處的吸光度，根據標準曲線方程計算樣品的蛋白質量濃度。

1.4 ? 數據處理

采用SPSS V19.0軟件進行數據分析，數據用x±s的形式表示，并進行單因素方差分析和Duncans顯著性檢驗，顯著性水平為P<0.05。

2 ? 結果與分析

2.1 ? 牦牛肉發酵單因素試驗結果

2.1.1 ? 發酵劑添加量對牦牛肉嫩化效果的影響

由圖1可知，隨著發酵時間延長，發酵劑添加量不同的牦牛肉pH值均呈下降趨勢。發酵0～6 h時，微生物開始生長繁殖，pH值下降較緩慢，發酵6 h后pH值下降明顯，這是由于乳酸菌大量繁殖，分解碳水化合物產生乳酸，導致pH值下降[24];發酵劑添加量越大，牦牛肉pH值下降速率越快，相同發酵時間內pH值越低;發酵18 h后，發酵劑添加量為1.5×106、2.0×106 CFU/g的牦牛肉pH值已降至5.0左右，24 h發酵結束后，添加發酵劑的牦牛肉pH值均降至5.0以下。

蒸煮損失率和剪切力都是表征肉嫩度的指標，蒸煮損失率和剪切力越低，表明肉越嫩[25]。由表2可知，添加發酵劑能顯著降低牦牛肉的蒸煮損失率（P<0.05），但不同添加量對蒸煮損失率影響不顯著（P>0.05）。發酵24 h后，發酵劑添加量為1.0×106、1.5×106 CFU/g的牦牛肉剪切力顯著降低（P<0.05），由于戊糖片球菌和植物乳桿菌能夠產生蛋白酶，提高肉中蛋白質的降解程度，使肌肉結構蛋白完整性被破壞，從而使牦牛肉剪切力變小，影響牦牛肉嫩度，同時pH值降低有利于肌原纖維蛋白的降解，并且在一定范圍內，pH值越低，肌原纖維蛋白降解程度越大[26]。發酵劑添加量過高，牦牛肉的pH值快速降低，口感過酸，食用品質不高，發酵劑添加量過低，牦牛肉pH值降低緩慢，發酵時間過久，會有雜菌生長。綜合考慮，選擇發酵劑添加量為1.0×106 CFU/g為宜。

2.1.2 ? 發酵溫度對牦牛肉嫩化效果的影響

發酵溫度對微生物生長繁殖、發酵進程和產品安全性均有很大影響。由圖2可知：20 ℃發酵時，牦牛肉pH值下降緩慢，24 h發酵結束時pH值只降低0.2～0.3;25 ℃發酵時，牦牛肉pH值的下降存在一定滯緩期，18 h后開始明顯降低，24 h降至5.3以下;高溫（30、35、40 ℃）條件下發酵時，牦牛肉pH值于發酵6 h后迅速下降，24 h后均降至5.0以下，且發酵同一時間段溫度越高，牦牛肉pH值越低。當發酵溫度過高時，發酵速率加快，最終pH值過低，產品酸度過高，影響肉品質，而且過高的溫度使肉中有害微生物在發酵初期大規模增殖，產品安全性無法得到保障[27]。

由表3可知，發酵24 h后，發酵溫度越高，各組牦牛肉的剪切力和蒸煮損失率越低，表明發酵牦牛肉嫩度越好。綜合考慮，發酵溫度為30 ℃時，可使牦牛肉的pH值達到較理想的效果，且肉的剪切力降至79.77 N，蒸煮損失率為40.13%，嫩度得到改善。

2.1.3 ? 發酵時間對牦牛肉嫩化效果的影響

由圖3可知，隨著發酵時間的延長，牦牛肉pH值呈下降趨勢。發酵開始后，牦牛肉pH值不斷下降，發酵16 h后，pH值從5.62降至5.27，發酵18 h后，牦牛肉pH值降至5.2以下，這一范圍可有效抑制腐敗菌和致病菌的生長[28]。發酵至20 h時，牦牛肉pH值下降速率減慢，隨著發酵時間的延長，微生物發酵產生的副產物會影響微生物的生長，使pH值下降速率趨于緩慢，此時牦牛肉pH值低于5.0，酸味較重，氣味較差。

由表4可知，發酵時間對牦牛肉的蒸煮損失率影響不顯著（P>0.05），剪切力隨發酵時間的延長先降低后升高，發酵18 h時剪切力顯著降低（P<0.05），表明此時牦牛肉的嫩度得到改善。發酵時間過長，牦牛肉中水分含量減少，肉質變硬。綜合考慮，發酵時間為18 h較為合適。

2.2 ? 牦牛肉發酵正交試驗優化結果

2.2.1 ? 正交試驗結果與分析

根據單因素試驗結果，以發酵劑添加量（A）、發酵溫度（B）及發酵時間（C）為自變量，以pH值、剪切力和可溶性蛋白含量為評價指標，進行3因素3水平的正交試驗。

[9] VAN WEZEMAEL L， DE SMET S， UELAND ?， et al. Relationships between sensory evaluations of beef tenderness， shear force measurements and consumer characteristics[J]. Meat Science， 2014， 97（3）： 310-315. DOI：10.1016/j.meatsci.2013.07.029.

[10] 王莉， 王玉濤， 郭麗君， 等. 電刺激對宰后牦牛肉成熟過程中肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白及嫩度的影響[J]. 食品工業科技， 2017， 38（11）： 65-70. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.004.

[11] 朱秀娟， 余群力， 李儒仁， 等. 采用響應面優化法研究木瓜蛋白酶嫩化牦牛肉的條件[J]. 食品工業科技， 2013， 34（20）： 230-234. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2013.20.066.

[12] 楊敏， 劉洋， 楊富民， 等. 不同鹽類對牦牛肉嫩化效果的影響研究[J]. 食品工業科技， 2014， 35（8）： 290-294. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.057.

[13] 湯高奇， 王彥平， 周志強， 等. 醋漬處理對牛肉嫩化效果的影響研究[J]. 食品科技， 2016， 41（7）： 126-130. DOI：10.13684/j.cnki.spkj.2016.07.024.

[14] LEE N， SHARMA V， BROWN N， et al. Functional properties of bicarbonates and lactic acid on chicken breast retail display properties and cooked meat quality[J]. Poultry Science， 2015， 94（2）： 302-310. DOI：10.3382/ps/peu063.

[15] GRAJALES A， RIVERA C， RUIZ M， et al. Effect of lactic acid on the meat quality properties and the taste of pork Serratus ventralis muscle[J]. Agricultural and Food Science， 2015， 21（2）： 171-181. DOI：10.23986/afsci.6082.

[16] NARAYAN R， MENDIRATTA S K， MANE B G. Effects of citric acid， cucumis powder and pressure cooking on quality attributes of goat meat curry[J]. Journal of Food Science and Technology， 2015， 52（3）： 1772-1777. DOI：10.1007/s13197-013-1023-x.

[17] 李林強， 昝林森， 張寶珣. 秦川牛肉在乳酸發酵過程中品質變化研究[J]. 食品科學， 2009， 30（7）： 131-134. DOI：10.3321/j.issn：1002-6630.2009.07.030.

[18] 王可， 祝超智， 趙改名， 等. 乳酸嫩化牦牛肉的工藝優化[J]. 肉類研究， 2019， 33（4）： 13-18. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190322-066.

[19] 王德寶， 靳燁， 其艷娟， 等. 發酵劑對羊肉干理化指標的影響及其分析研究[J]. 食品工業， 2015， 36（1）： 74-76.

[20] 盧智， 柳青山， 朱俊玲. 幾種蛋白酶與氯化鈣對雞肉系水力的影響[J]. 食品研究與開發， 2018， 39（5）： 24-27. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2018.05.005.

[21] 趙立， 周振， 賀倩倩， 等. 超聲波與菠蘿蛋白酶協同作用對鴨肉嫩化的影響[J]. 食品科學， 2018， 39（12）： 93-100. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201812015.

[22] 孔令明， 李芳， 張文， 等. 不同電刺激處理時間對宰后馬肉成熟過程中嫩度的影響[J]. 食品科學， 2018， 39（9）： 76-81. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201809012.

[23] 王兆明. 兔肉滾揉腌制工藝及品質特性變化研究[D]. 重慶： 西南大學， 2016： 28-29.

[24] 張波， 李開雄， 盧士玲， 等. 發酵劑對風干羊肉理化特性變化和蛋白質降解的影響[J]. 食品工業科技， 2013， 34（14）： 197-200. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2013.14.063.

[25] 王晶， 田瑩俏， 張艷花. 菠蘿蛋白酶和超聲波對羊肉嫩度的影響[J]. 肉類工業， 2015（3）： 14-18. DOI：10.3969/j.issn.1008-5467.2015.03.006.

[26] 樊明明， 郇延軍， 翁梅芬， 等. 添加發酵劑對豬肉脯品質的影響[J]. 食品工業科技， 2015， 36（15）： 122-125; 129. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.018.

[27] 楊秀娟， 王艷梅， 馬儷珍. 以植物乳桿菌和戊糖片球菌為發酵劑的發酵香腸工藝研究[J]. 肉類研究， 2007， 21（8）： 22-26. DOI：10.3969/j.issn.1001-8123.2007.08.008.

[28] 王新惠， 李俊霞， 譚茂玲， 等. 復合發酵劑對發酵豬肉干品質的影響[J]. 食品工業科技， 2015， 36（17）： 165-169. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2015.17.025.

[29] 譚汝成， 歐陽加敏， 盧曉莉， 等. 接種植物乳桿菌和戊糖片球菌發酵對魚鲊品質的影響[J]. 食品科學， 2007（12）： 268-272. DOI：10.3321/j.issn：1002-6630.2007.12.062.

[30] 張飛， 路洪艷， 劉哲， 等. 兩種乳酸菌協同發酵冷鮮調理牛肉的工藝優化[J]. 食品科技， 2016， 41（1）： 100-104. DOI：10.13684/j.cnki.spkj.2016.01.021.