福建楓香炭疽病病原的種類鑒定

朱仰艷 蘇錦鈺 潘愛芳 何學(xué)友 胡紅莉

摘 ?要 ?在調(diào)查福建霞浦楊家溪榕楓公園和福州森林公園的楓香樹葉部病害過(guò)程中，分離得到了6株形態(tài)特征有差異的炭疽菌，并采用形態(tài)特征與多基因位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析相結(jié)合的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。形態(tài)特征包括菌落性狀、分生孢子盤、分生孢子梗及分生孢子等;系統(tǒng)發(fā)育分析包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、β-微管蛋白（TUB2）、肌動(dòng)蛋白（ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）和幾丁質(zhì)合成酶（CHS-1）5個(gè)基因。研究明確了這6個(gè)菌株可鑒定為炭疽菌的3個(gè)種，即膠孢炭疽復(fù)合種中的果生炭疽菌C. fructicola和熱帶炭疽菌C. tropicale，以及尖孢炭疽復(fù)合種中的松針炭疽菌C. fioriniae。經(jīng)柯赫氏法則的驗(yàn)證，這3個(gè)炭疽菌種均可引起楓香炭疽病，但致病力有所不同。這也是C. fructicola、C. tropicale和C. fioriniae引起楓香炭疽病的首次報(bào)道。

關(guān)鍵詞 ?炭疽病;楓香;種類鑒定;系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào) ?R379 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?Six morphologically different Colletotrichum strains were obtained during the investigation of Liquidambar formosana Hance leaf diseases in Fujian. The six strains were identified based on morphology （colony， acervuli， conidiophores and conidia） and multi-loci （ITS， TUB2， ACT， GAPDH and CHS-1） phylogenetic analyses. The six strains belonged to three Colletotrichum species， i.e.， C. fructicola， C. tropicale and C. fioriniae， which belonged to Colletotrichum gloeosporioides complex and Colletotrichum actatum complex， respectively. The results from Kochs postulates supported the three Colletotrichum species could cause leaf anthracnose to Liquidambar formosana， and the pathogenecity of them was different. This is the first report of the three Colletotrichum species to cause leaf anthracnose on Liquidambar formosana.

Keywords ?anthracnose; Liquidambar formosana; identification; phylogenetic analyses

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.11.014

楓香（Liquidambar formosana Hance）為金縷梅科楓香屬植物，別名楓樹，為落葉喬木，樹干筆直高聳，適應(yīng)性強(qiáng)，是優(yōu)良的園林觀賞樹種和行道樹種[1]。楓香在生長(zhǎng)過(guò)程中容易發(fā)生病蟲害，嚴(yán)重影響楓香的生長(zhǎng)和觀賞價(jià)值[2]。

2017年在福建霞浦楊家溪榕楓公園及福州森林公園的楓香葉片上發(fā)現(xiàn)了較為嚴(yán)重的葉部病害，導(dǎo)致楓香葉片在變黃或變紅前就凋落，嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值。我們?cè)谡{(diào)查楓香葉部病害的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)引起楓香葉部病害的病原菌不止1種，僅炭疽菌屬就分離純化得到了6株形態(tài)特征有差異的菌株。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，2000年Lu等[3]在《香港真菌列表》里報(bào)道過(guò)香港楓香上膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的有性階段圍小叢殼菌（Glomerella cingulata），2018年何學(xué)友和潘愛芳[2]在《中國(guó)楓香病蟲害》一書中提到的未鑒定到種的炭疽菌屬真菌就是本文中獲得的菌株。

目前國(guó)際上通用的炭疽菌屬的分類主要基于形態(tài)特征和多基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，已確定了14個(gè)復(fù)合種和15個(gè)獨(dú)立種[4-5]。有學(xué)者也多次報(bào)道在同一寄主上分布著不同炭疽菌，比如山茶屬和辣椒上都發(fā)現(xiàn)了多種炭疽菌[6-7]，但國(guó)內(nèi)對(duì)楓香上的炭疽菌未見詳細(xì)的報(bào)道[3]。本研究擬通過(guò)分離楓香葉部炭疽病的病原物，對(duì)病原物的形態(tài)特征進(jìn)行觀察和差異比對(duì)，結(jié)合病原物的致病性實(shí)驗(yàn)以及多基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析的方法，明確楓香葉部炭疽病病原的種類，以期為楓香炭疽病的防治提供參考依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

2017年9月，在福建霞浦楊家溪榕楓公園和福州森林公園（SLGY）采集楓香樹的發(fā)病葉片，可以觀察到2種主要的病斑特征，分別是褐斑及黑斑（圖1），其中褐斑可以在葉片及葉柄（本研究中將葉片基部以下劃分為葉柄）上觀察到，并分別標(biāo)記為HB及YB，而將黑斑標(biāo)記為OHB（文中關(guān)于菌株的編號(hào)均參照此標(biāo)記）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?病原菌的分離、純化及保存 ?在發(fā)病部位的病健交界處剪取大小約為1.5 mm×1.5 mm左右的葉片，將其放入75%的酒精中浸泡45 s取出，用無(wú)菌水沖洗3次，置于滅過(guò)菌的濾紙片上，吸干水分后，放入PDA培養(yǎng)基上，并置于26 ℃、光周期為12 h光暗交替的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察，如有菌絲從葉片組織周圍長(zhǎng)出，進(jìn)行純化，將純化得到的純菌落保存在PDA試管斜面，放置于4 ℃冰箱保存。

將獲得的純菌落用接種針挑取菌絲至PDA培養(yǎng)基上，封口后放于26 ℃，光周期為12 h的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 d后，觀察其菌落形態(tài)并測(cè)量記錄其菌落直徑的大小。培養(yǎng)7 d后，觀察其是否產(chǎn)孢。如果產(chǎn)孢，制作臨時(shí)水玻片，拿到顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子等形態(tài)特征，并拍照、測(cè)量（孢子的長(zhǎng)度和寬度）和記錄（每株供試菌株測(cè)量30個(gè)孢子并求其平均值來(lái)確定該供試菌株孢子的大小）。如沒(méi)產(chǎn)孢，將菌絲劃斷造成脅迫使其產(chǎn)孢，即用滅過(guò)菌的1 mL槍頭在培養(yǎng)基上打孔（4～5個(gè)）后，將其放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周后，觀察到在孔口周圍有橘黃色的孢子堆產(chǎn)生。此后的觀察方法同上。

1.2.2 ?DNA粗提及PCR擴(kuò)增 ?DNA提取采用真菌基因組粗提取法（1 mol/L Tris-HCL，pH 8.0，0.5 mol/L EDTA，20% SDS，5 mol/L NaCl），對(duì)獲得的DNA進(jìn)行多基因PCR擴(kuò)增[ITS（ITS1和ITS4）[8-9]，TUB2（BT2A和BT2B）[10]，ACT（ACT-512F和ACT-783R）[11]，GAPDH（GDF和GDR）[12]，CHS-1（CHS-79F和CHS-345R）[11]]，擴(kuò)增后取5 ?L PCR產(chǎn)物加至1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，當(dāng)條帶明亮清晰無(wú)雜帶，且條帶大小與所擴(kuò)基因片段大小相同時(shí)，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至博尚公司測(cè)序。

在BioEdit[13]中對(duì)獲得的序列進(jìn)行修正，將修正過(guò)的序列放入NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）中進(jìn)行BLAST，得到初步的比對(duì)結(jié)果。根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，從NCBI中選取42個(gè)炭疽菌種的序列作為參考序列，加上本研究中獲得的6個(gè)菌株的序列（表1），一起用于系統(tǒng)發(fā)育分析。用PhyloSuite[14]進(jìn)行單基因序列的比對(duì)及多基因序列串聯(lián)在一起后，分別使用IQ-tree[15]進(jìn)行最大似然（maximum likelihood，ML）分析及使用MrBayes[16]進(jìn)行貝葉斯（Bayesian inference，BI）分析，并將獲得的不同系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)比較。最后用Figtree（https：//www. softpedia.com/get/Science-CAD/FigTree-AR.shtml）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行注釋。

1.2.3 ?致病性測(cè)試 ?為了確認(rèn)所得菌株的致病性，取楓香的健康幼嫩葉片及成熟葉片（大小及葉片顏色相似）用自來(lái)水輕微沖洗后，用草紙吸干;將準(zhǔn)備好的葉片放入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中（皿內(nèi)放有2張濾紙并已用水潤(rùn)濕），葉柄用棉花包裹后并將棉花潤(rùn)濕，培養(yǎng)皿內(nèi)保持濕潤(rùn)但無(wú)積水;每株供試菌接5點(diǎn)，分別為葉片的3個(gè)葉尖、葉中及葉柄，每張葉片3個(gè)重復(fù)，用10 ?L槍頭對(duì)葉片進(jìn)行輕微造傷后，將打好的菌柄放于造傷處;蓋好蓋子后置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d（5 d后有病斑出現(xiàn)）后拍照記錄，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?病原菌形態(tài)鑒定

本研究從感病的楓香葉片及葉柄分離得到6株炭疽菌菌株，其具體形態(tài)特征見圖2和表2。根據(jù)菌落的性狀、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子梗、分生孢子等形態(tài)特征將6個(gè)菌株分為3組，即FX HB 2、FX HB SLGY 2、FX YB 3和FX HB 3分為第1組，F(xiàn)X OHB 1 2為第2組，而FX YB SLGY 2為第3組。通過(guò)與已知的炭疽菌種進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，前2組的形態(tài)特征（分生孢子盤褐色，有時(shí)在盤中央可見錐刺狀褐色剛毛;分生孢子無(wú)色、單胞、表面光滑、棍棒狀、兩端稍鈍圓）與膠孢炭疽復(fù)合種（Colletotrichum gloeosporioides species complex）的形態(tài)特征相似[17]，其中，第1組與果生炭疽菌C. fructicola的描述相符，第2組與熱帶炭疽菌C. tropicale的描述相符[18];第3組的形態(tài)特征（分生孢子無(wú)色，單胞，表面光滑，似梭形，兩端稍鈍）與尖孢復(fù)合種（Colletotrichum acutatum species complex）松針炭疽菌C. fioriniae的描述相符[19]。

2.2 ?病原菌序列系統(tǒng)發(fā)育分析

單基因序列分析（ACT，CHS-1，GADPH，ITS，TUB2）和多基因序列聯(lián)合（5個(gè)基因位點(diǎn)串聯(lián)）分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，但是多基因序列分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹部分分支的支持率（SH-aLRT≥75%，bootstrap support≥95%）更高。本研究采用多基因序列分析（圖3）。從圖3可以看出，第1組和第2組的菌株分布在膠孢炭疽復(fù)合種（Colletot?ri???chum gloeosporioides complex），第1組的菌株與果生炭疽菌C. fructicola聚在一起，支持率分別為97和100;第2組的菌株與熱帶炭疽菌C. trop?icale聚在一起，支持率分別為74%和95%。第3組的菌株與尖孢炭疽復(fù)合種（Colletotrichum acu???ta?tum complex）的松針炭疽菌C. fioriniae聚在一起，支持率分別為99%和100%。從上述結(jié)果來(lái)看，系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果支持了形態(tài)鑒定。

2.3 ?病原菌致病性測(cè)試

3 ?討論

目前國(guó)際通用的炭疽菌屬真菌分類鑒定的方法，主要是結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)（多基因位點(diǎn)的系統(tǒng)發(fā)育分析），即比較形態(tài)特征（包括菌落大小、顏色，無(wú)性態(tài)與有性態(tài)的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)特征，以及有無(wú)剛毛等）的分類與多基因序列組合分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而選擇對(duì)不同復(fù)合種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的最適基因位點(diǎn)[17， 20-21]。但對(duì)于不同的復(fù)合種（species complex），所用的基因位點(diǎn)有所不同，比如：在膠孢炭疽復(fù)合種（Colletotrichum gloeosp?orio?ides complex）的研究中運(yùn)用到了ITS、GAPDH、CAL、ACT、CHS-1、GS、SOD2和TUB2等8個(gè)基因位點(diǎn)[17]，在博寧炭疽復(fù)合種（Colletotr?i?chu?m boninense complex）的研究中運(yùn)用到了ITS、ACT、TUB2、CHS-1、GAPDH、HIS3以及CAL等7個(gè)基因位點(diǎn)[21]，而對(duì)于尖孢炭疽復(fù)合種（Colletotrichum acutatum complex）的研究，前人則運(yùn)用ITS、ACT、TUB2、CHS-1、GAPDH、HIS3等6個(gè)基因位點(diǎn)[22]。本文運(yùn)用了形態(tài)學(xué)與多基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析相結(jié)合的方法，因?yàn)閷?duì)于不同的復(fù)合種運(yùn)用的基因位點(diǎn)既有相同的位點(diǎn)也有不同的位點(diǎn)，并且在本研究中是將膠孢炭疽復(fù)合種和尖孢炭疽復(fù)合種放在一塊兒分析，所以就選取了ACT、CHS-1、GAPDH、TUB2、ITS等5個(gè)基因位點(diǎn)對(duì)分離到的6個(gè)炭疽菌菌株進(jìn)行分析，并將引起楓香炭疽病的6個(gè)炭疽菌菌株具體鑒定到3個(gè)種，即膠孢炭疽復(fù)合種（Colletotrichum gloeosporioides complex）的果生炭疽菌C. fructicola和熱帶炭疽菌C. tropicale，以及尖孢炭疽復(fù)合種（Colletotrichum acutatum complex）的松針炭疽菌C. fioriniae。這2個(gè)復(fù)合種的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析得到系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)跟中國(guó)辣椒上炭疽病菌[7]的研究報(bào)道相似。這也驗(yàn)證了本文中系統(tǒng)發(fā)育樹的準(zhǔn)確性。

前人多次報(bào)道在同一寄主上分布不同炭疽菌，比如山茶屬和辣椒上都發(fā)現(xiàn)了多種炭疽菌，常見的炭疽菌種類包括松針炭疽菌C. fioriniae、果生炭疽菌C. fructicola、膠孢炭疽菌C. gloeosporioides等[6-7]，除此之外，像辣椒炭疽菌Colletotrichum capsici不僅存在于辣椒上，在南瓜上也有發(fā)現(xiàn)[23]。因此有些炭疽菌并不是某些植物上特有的，這說(shuō)明多種炭疽菌在同一種植物上出現(xiàn)的可能性很大，但有些炭疽菌有寄主偏好性。因?yàn)橹拌b定手段的局限性，楓香上只報(bào)道過(guò)膠孢炭疽菌的有性階段圍小叢殼[3]，本文在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)楓香炭疽病的病原菌種類進(jìn)行了鑒定，首次報(bào)道楓香上的3種不同炭疽菌，即果生炭疽菌C. fructicola、熱帶炭疽菌C. tropicale和松針炭疽菌C. fioriniae。雖然同一寄主上有不同的炭疽菌，大部分都可以致病，但不同炭疽菌在同一寄主上的致病性也是有差異的。例如，在對(duì)梨屬（Pyrus）植物上的炭疽菌進(jìn)行研究時(shí)，致病性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，膠孢炭疽復(fù)合種、尖孢炭疽復(fù)合種和博寧炭疽復(fù)合種的炭疽菌在致病性上存在差異，如生炭疽菌C. fructicola對(duì)梨的果實(shí)和葉片的致病性高于松針炭疽菌C. fioriniae[24]。與本文的研究結(jié)果相一致，即對(duì)于楓香的葉片及葉柄而言，果生炭疽菌C. fructicola和熱帶炭疽菌C. tropicale引起的病斑比松針炭疽菌C. fioriniae引起的病斑大。

在已報(bào)道的研究中，多數(shù)病原菌接種實(shí)驗(yàn)都是用孢子懸浮液[24]，對(duì)不產(chǎn)孢的菌株，則用菌絲塊接種。本文中使用菌絲塊做致病性實(shí)驗(yàn)，3次重復(fù)的結(jié)果顯示，對(duì)于葉片的接種而言，果生炭疽菌C. fructicola、熱帶炭疽菌C. tropicale和松針炭疽菌C. fioriniae引起的病斑大小差異較小，但是3個(gè)種在葉柄上的接種結(jié)果差異比較大。為了提高致病性實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在后續(xù)的研究過(guò)程中，會(huì)找出促進(jìn)文中3種炭疽菌的最適產(chǎn)孢方式并進(jìn)行孢子懸浮液接種，從而更好地比較果生炭疽菌C. fructicola、熱帶炭疽菌C. tropicale和松針炭疽菌C. fioriniae 3種炭疽菌的致病力。

參考文獻(xiàn)

[1] 張?jiān)葡迹?魯海菊， 陳潤(rùn)瓊， 等. 草果葉斑病和楓香干腐病的病原菌鑒定[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 20（3）： 438-440.

[2] 何學(xué)友， 潘愛芳. 中國(guó)楓香病蟲害[M]. 北京： 中國(guó)林業(yè)出版社， 2018.

[3] Lu B， Hyde K D， Ho W H， et al. Checklist of Hong Kong Fungi[M]. Hong Kong： Fungal Diversity Press， 2000.

[4] Marin-felix Y， Groenewald J Z， Cai L， et al. Genera of phytopathogenic fungi： GOPHY 1[J]. Studies in Mycology， 2017， 86： 99-216.

[5] Damm U， Sato T， Alizadeh A， et al. The Colletotrichum dracaenophilum， C. magnum and C. orchidearum species complexes[J]. Studies in Mycology， 2019， 92： 1-46.

[6] Liu F， Weir B S， Damm U， et al. Unravelling Colletotrichum species associated with Camellia： employing ApMat and GS loci to resolve species in the C. gloeosporioides complex[J]. Persoonia， 2015， 35： 63-86.

[7] DiaoY Z， Zhang C， Liu F， et al. Colletotrichum species causing anthracnose disease of chili in China[J]. Persoonia， 2017， 38（1）： 20-37.

[8] Grades M， Bruns T D. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes-application to the identification of mycorrhizae and rusts[J]. Molecular Ecology， 1993， 2（2）： 113-118.

[9] White T J， Bruns T， Lee S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//Innis M A， Gelfand D H， Sninsky J J， et al. PCR Protocols： a guide to methods and applications. San Diego， USA： Academic Press， 1990， 38： 315–322.

[10] Glass N L， Donaldson G C. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1995， 61（4）： 1323-1330.

[11] Carbone I， Kohn L M. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes[J]. Mycologia， 1999， 91（3）： 553-556.

[12] Templeton M D， Rikkerink E H， Solon S L， et al. Cloning and molecular characterization of the glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase-encoding gene and cDNA from

the plant pathogenic fungus Glomerella cingulata[J]. Gene （Amsterdam）， 1992， 122（1）： 225-230.

[13] Hall T A. BioEdit： a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT[J]. Nucleic Acids Symposium Series， 1999， 41： 95-98.

[14] Zhang D， Gao F， Li W X， et al. PhyloSuite： an integrated and scalable desktop platform for streamlined molecular sequence data management and evolutionary phylogenetics studies[J/OL]. Molecular Ecology Resources， 2019， doi：org/10.1111/1755-0998.13096

[15] Nguyen L T， Schmidt H A， Von Haeseler A， et al. IQ-TREE： a fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies[J]. Molecular Biology and Evolution， 2015， 32（1）： 268-274.

[16] Huelsenbeck J P， Ronquist F. MRBAYES： Bayesian inference of phylogenetic trees[J]. Bioinformatics， 2001， 17（8）： 754-755.

[17] Weir B S， Johnston P R， Damm U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex[J]. Studies in Mycology， 2012， 73（1）： 115-180.

[18] Rojas E I， Rehenr S A， Samuels G J， et al. Colletotrichum gloeosporioides s.l. associated with Theobroma cacao and other plants in Panama： multilocus phylogenies distinguish host-associated pathogens from asymptomatic endophytes [J]. Mycologia， 2010， 102（6）： 1318-1338.

[19] Shivas R G， Tan Y P. A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum， introducing C. fioriniae comb. et stat. nov. and C. simmondsii sp. nov.[J]. Fungal Diversity， 2009， 39： 111-122.

[20] Sharma G， Pinnaka A K， Shenoy B D. Resolving the Colletotrichum siamense species complex using ApMat marker[J]. Fungal Diversity， 2014， 71（1）： 247-264.

[21] Damm U， Cannon P F， Woudenberg J H， et al. The Colletotrichum boninense species complex[J]. Studies in Mycology， 2012， 73（1）： 1-36.

[22] Damm U， Cannon P F， Woudenberg J H， et al. The Colletotrichum acutatum species complex[J]. Studies in Mycology， 2012， 73（1）： 37-113.

[23] Chai A L， Zhao Y J， Shi Y X， et al. Identification of Colletotrichum capsici （ Syd.） Butler causing anthracnose on pumpkin in China[J]. Canadian Journal of Plant Pathology， 2014， 36（1）： 121-124.

[24] Fu M， Crous P W， Bai Q， et al. Colletotrichum species associated with anthracnose of Pyrus spp. in China[J]. Persoonia， 2019， 42： 1-35.