表沒食子兒茶素沒食子酸酯對肥胖的影響及其機制

尹建國，張社兵，彭道泉

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 韶關(guān) 512026；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心血管內(nèi)科，長沙 410011）

肥胖是個體攝入的能量大于消耗，多余能量轉(zhuǎn)化為脂肪儲存在脂肪細胞中的病理生理過程；肥胖與胰島素抵抗、高脂血癥、高血壓密切相關(guān)，是動脈粥樣硬化的危險因素之一。體內(nèi)的脂肪組織可分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織。白色脂肪組織的主要功能是儲存脂質(zhì)，蓄積能量；棕色脂肪組織的主要功能是產(chǎn)熱，調(diào)節(jié)體溫，有減肥的作用。二者的主要區(qū)別在于棕色脂肪細胞線粒體中特異性表達解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1），UCP1能使線粒體氧化與ATP生成解偶連，能量以熱能的形式散發(fā)，因此也被稱作“產(chǎn)熱素”。有研究［1］表明，飲用綠茶有減肥的作用，綠茶的主要活性成分是EGCG，EGCG約占綠茶干重的30%～40%。但是EGCG減肥的確切機制不清，本研究通過觀察EGCG對小鼠體質(zhì)量的影響，進一步探討EGCG對肥胖及脂肪細胞UCP1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6J雄性小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限責(zé)任公司，高脂飼料購自上海福貝世亨生物醫(yī)藥有限公司；3T3-L1細胞為湘雅二醫(yī)院心血管內(nèi)科實驗室保存；EGCG購自美國Sigma公司；RNA提取及反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；UCP1、β-actin兔抗鼠一抗購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；其余試劑均為湘雅二醫(yī)院心血管內(nèi)科實驗室提供。

1.2 小鼠的分組與干預(yù)

24只C57BL/6J小鼠正常飼料飼養(yǎng)1周后隨機分為3組（每組8只）：對照組，予以高脂飲食；小劑量EGCG組，予以高脂飲食加50 mg/kg EGCG灌胃；高劑量EGCG組，予以高脂飲食加150 mg/kg EGCG灌胃。飼養(yǎng)16周后記錄體質(zhì)量，處死小鼠，分離腹部脂肪組織。

1.3 細胞培養(yǎng)與干預(yù)

3T3-L1細胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基置于含5%CO2、37 ℃、濕度100%的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞狀態(tài)良好后計數(shù)隨機分組，每組1.5×106個細胞，在含胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中加入不同濃度（0、20、100 μmol/L）EGCG誘導(dǎo)分化為脂肪細胞，8 d后3T3-L1細胞分化為成熟脂肪細胞。

1.4 Western blotting檢測UCP1表達

小鼠脂肪組織及分組干預(yù)的3T3-L1脂肪細胞裂解高速離心后取上清液，BCA法測蛋白濃度。取50 μg上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST溶液浸泡封閉2 h，加入1∶1 000的UCP1一抗，4 ℃孵育過夜。次日PBST液漂洗3次，相應(yīng)稀釋后二抗室溫孵育2 h，再用PBST液漂洗3次。ECL化學(xué)發(fā)光顯影，在柯達化學(xué)發(fā)光成像儀中自動顯影。用圖像分析軟件進行灰度值分析，測得的各目的蛋白的灰度值與相應(yīng)內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值即為該蛋白的相對表達量。

1.5 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測UCP1 mRNA的表達

按照試劑盒說明書提取小鼠脂肪組織及3T3-L1分化脂肪細胞RNA，行反轉(zhuǎn)錄PCR檢測UCP1mRNA的表達水平。小鼠UCP1引物序列：正義 鏈5’-GCCTTCAGATCCAAGGTGAA-3’，反 義 鏈5’-TAAGCCGGCTGAGATCTTGT-3’。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用±s表示，數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性分析，不符合正態(tài)分布的變量均先經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，再作進一步統(tǒng)計分析。2組均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對小鼠體質(zhì)量的影響

3組小鼠飼養(yǎng)16周后，對照組、小劑量EGCG組、高劑量EGCG組小鼠體質(zhì)量分別為（46.3±3.1）、（39.7±2.8）、（35.6±2.7）g；與對照組比較，小劑量EGCG組和高劑量EGCG組小鼠體質(zhì)量減輕（P＜0.01）；且高劑量EGCG組小鼠體質(zhì)量較EGCG低劑量組進一步減輕（P＜ 0.05）。

2.2 EGCG對小鼠脂肪組織UCP1蛋白表達的影響

與對照組比較，小劑量EGCG組和高劑量EGCG組小鼠腹部脂肪組織中UCP1蛋白表達明顯升高（P＜ 0.01）；且高劑量EGCG組UCP1蛋白表達較EGCG低劑量組明顯增加（P＜ 0.01）。見圖1。

2.3 EGCG對3T3-L1來源脂肪細胞UCP1蛋白表達的影響

與對照組比較，20和100 μmol/L EGCG組3T3-L1來源脂肪細胞中UCP1表達明顯增加（P＜ 0.01）；隨EGCG濃度升高，UCP1表達呈上升趨勢（P＜ 0.01），見圖2。

2.4 EGCG對小鼠腹部脂肪組織及3T3-L1來源脂肪細胞UCP1 mRNA表達的影響

在小鼠腹部脂肪組織中，與對照組比較，小劑量EGCG組和高劑量EGCG組UCP1mRNA表達明顯上調(diào)（P＜ 0.01）。在3T3-L1來源脂肪細胞中，與對照組比 較，20和100 μmol/L EGCG組UCP1mRNA表達明顯上調(diào)（P＜ 0.01）。見圖3。

3 討論

圖1 EGCG對小鼠脂肪組織UCP1蛋白表達的影響Fig.1 Effect of EGCG on UCP1 protein expression in adipose tissue

圖2 EGCG對3T3-L1來源脂肪細胞UCP1蛋白表達的影響Fig.2 Effect of EGCG on UCP1 protein expression in 3T3-L1-derived adipocytes

圖3 EGCG對小鼠腹部脂肪組織及3T3-L1來源脂肪細胞UCP1 mRNA表達的影響Fig.3 Effect of EGCG on UCP1mRNA expression in mouse adipose tissue and 3T3-L1-derived adipocytes

綠茶是全世界廣受歡迎的飲料，綠茶有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、降低膽固醇、減輕體質(zhì)量、改善胰島素抵抗、減輕肝臟脂質(zhì)沉積等作用［2-6］。研究［7］顯示，綠茶飲用量與體脂含量及腰圍呈負相關(guān)。EGCG是綠茶的主要活性成分，EGCG可通過增加脂質(zhì)排泄，減少脂肪吸收，抑制脂肪合成酶活性減少脂肪合成，促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運及其從腸道排泄，激活交感神經(jīng)活性促進脂肪氧化分解等多個環(huán)節(jié)調(diào)控脂質(zhì)代謝，減輕體質(zhì)量。單純性肥胖主要是機體攝入能量大于消耗，能量以脂肪的形式在體內(nèi)蓄積，這種脂肪組織是白色脂肪組織。目前認為白色脂肪組織不是單純能量蓄積庫，同時也能分泌促炎性細胞因子，如白細胞介素-6、腫 瘤 壞 死 因子-α、纖溶酶原激活物抑制劑-1等。這些促炎性細胞因子促進動脈粥樣硬化、胰島素抵抗等病理生理過程的發(fā)生發(fā)展。在人體嬰幼兒期及其他小型哺乳動物體內(nèi)存在另外一種脂肪組織——棕色脂肪組織，棕色脂肪組織儲存脂質(zhì)的能力有限，高表達UCP1，其主要功能是產(chǎn)熱、調(diào)節(jié)體溫，促進脂肪組織細胞表型轉(zhuǎn)化，促進UCP1表達，增加脂肪氧化與ATP生成解偶連。有研究［8］表明，EGCG能在白色脂肪細胞上誘導(dǎo)與棕色脂肪細胞相關(guān)的基因表達，這是EGCG抗肥胖的作用機制之一。但目前關(guān)于EGCG對UCP1的影響研究較少。

本研究結(jié)果顯示，EGCG能上調(diào)3T3-L1來源脂肪細胞UCP1的轉(zhuǎn)錄表達，促進白色脂肪細胞的表型向棕色脂肪細胞轉(zhuǎn)化，UCP1轉(zhuǎn)錄表達上調(diào)能促進脂肪細胞脂肪氧化與ATP生成解偶連，增加熱能的產(chǎn)生，促進能量的消耗。同時在小鼠體內(nèi)證實，EGCG能上調(diào)脂肪細胞UCP1的轉(zhuǎn)錄表達，減輕肥胖小鼠的體質(zhì)量。綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)EGCG通過上調(diào)UCP1轉(zhuǎn)錄表達，從而減輕肥胖小鼠的體質(zhì)量，這為認識綠茶的減肥機制提供科學(xué)依據(jù)，同時為減肥產(chǎn)品的開發(fā)提供思路。