不同程度腎積水家兔模型在不同壓力腎盂灌注下的腎損傷

黃倩，柳懿鵬

（武漢市第一醫院泌尿外科，武漢 430022）

輸尿管鏡碎石術和經皮腎鏡碎石術已廣泛用于治療上尿路結石，比起傳統的開放手術，具有并發癥少、患者住院時間短的優勢［1］。這些腔內手術需要沖洗，以保持清晰的手術視野并沖出結石碎屑。研究［2］報道，腎盂壓力超過30 mmHg時，可能會出現腎盂靜脈淋巴回流，在某些情況下，可能會導致嚴重的腎損傷。所以，目前一些研究［3］建議將灌注壓力維持在50～300 mmHg。這一壓力區間跨度較大，不同程度積水的腎臟，其術中能承受的腎盂灌注壓力可能會不同。因此，本研究建立不同程度腎積水的家兔模型，對比觀察不同壓力的腎盂灌注對腎臟的損傷程度。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

54只清潔健康成年雄性新西蘭白兔，體質量（2.2±0.2）kg，購自武漢生物制品研究所，生產批號：2017RN93。按照實驗室標準方法飼養1周。將家兔隨機分為對照組（n=6）和實驗組（n=48）。實驗組通過手術操作分別形成輕度（M組，n=24）和重度（S組，n=24）腎盂積水模型，M組和S組均細分為4個亞組，即M0～M3組和S0～S3組（每個亞組n=6），M0、S0組未進行灌注，M1～M3、S1～S3組分別以20、60、100 mmHg的壓力進行腎盂灌注。對照組家兔進行麻醉和手術，但不造成腎積水。

1.2 手術操作

家兔禁食8 h，稱重，通過耳緣靜脈注射戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉后，將家兔以仰臥位固定在電熱毯上，維持正常體溫，腹部正中切口暴露左輸尿管、腰大肌。M組中，將左輸尿管的上四分之一包埋在腰大肌中；S組中，將左輸尿管的上三分之二包埋在腰大肌中［4］；對照組家兔暴露左輸尿管、腰大肌，但不包埋輸尿管，然后關閉腹腔。手術后2周，用B超觀察腎積水情況，M和S組中腎盂擴張分別為（0.98±0.31）cm和（1.72±0.32）cm，實質厚度分別為（0.31±0.08）cm和（0.23±0.05）cm。2組比較，腎盂擴張程度及腎實質厚度的差異均有統計學意義（P＜0.05）。

觀察腎積水情況后，進行再次手術，暴露積水腎臟，將0.7G頭皮針插入腎盂，并連接壓力記錄儀（MP150型，美國Biopac公司），記錄腎盂壓力。灌注前，測量M和S組的腎盂壓力，分別為（9.43±1.86）mmHg和（15.91±2.79）mmHg，差異有統計學意義（P＜0.05）。將另一個0.7G頭皮針插入腎盂，連接壓力泵（UDS64-Ⅲ型，加拿大Laborie公司），用37 ℃生理鹽水進行灌注，M1～M3組和S1～S3組灌注壓力分別為20、60、100 mmHg，灌注8 min后停止2 min，重復操作4次，而M0組和S0組未進行灌注。灌注后，將包埋入腰大肌的輸尿管松解，關閉腹腔。48 h后處死家兔，收集左腎，觀察各項指標。

1.3 中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）表達的檢測

采用免疫組織化學方法染色及評估：用10%甲醛固定組織10 h，隨后用石蠟包埋組織，切成5 μm厚的切片，再將組織切片浸入二甲苯中進行脫蠟，然后用乙醇再水化，微波抗原修復和滅活內源酶后，加一抗（美國Santa Cruz Biotechnology公司）在4 ℃的溫箱中培養過夜，然后加入生物素化的二抗、辣根過氧化物酶及3，30-二氨基聯苯胺，蘇木精復染后，用1%鹽酸乙醇純化切片，經梯度乙醇脫水，再用二甲苯清洗，裝于凝膠中。于光鏡下觀察，每個視野選擇5個區域，每個區域觀察100個腎小管上皮細胞，觀察每個切片上陽性染色細胞百分比。切片評分如下：0，無染色；1，染色＜25%；2，染色25%～＜50%；3，染色50%～＜75%；4，染色≥75%［5］。3位病理學家通過倒置相差顯微鏡（IX70-81FZ型，日本Olympus公司）對所有切片進行評分。

1.4 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平的測定

將組織放入20 mmol/L氨丁三醇緩沖劑中，用分散機（IKA T25型，德國Staufen公司）將組織均質化，為防止均質化過程中可能出現的脂質過氧化反應，加入5 mmol/L的丁羥甲苯。在4 ℃環境下，以12 000g離心均漿，用上清液測量SOD和MDA活性。根據測定條件，將每毫克組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時對應的SOD量為一個SOD活性單位，SOD活性單位以U/mg表示［6］。根據MDA-TBA復合物的吸光系數計算MDA，單位以μmol/g表示［7］。

1.5 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）水平的檢測

將腎組織放入EDTA胰蛋白酶溶液（中國碧云天生物技術研究所）中消化，然后加入小牛血清終止消化。收集懸浮細胞，于37 ℃下用MMP熒光探針JC-1（C25H27Cl4IN4）加載20 min，用流式細胞儀（FACS Aria Ⅲ型，美國BD公司）洗滌并分析細胞。MMP水平較低時，JC-1主要作為單體存在，發出綠色熒光（激發波長490 nm，發射波長530 nm），MMP水平較高時，JC-1主要作為聚合物存在，發出紅色熒光（激發波長525 nm，發射波長590 nm）［8］。用紅色熒光強度與綠色熒光強度之比，表示腎組織MMP的水平。

1.6 線粒體空泡化比例

用2.5%戊二醛將切分好的腎組織固定，在0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液中漂洗3次，然后在1%鋨酸固定液中固定，再用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液漂洗，隨后在梯度乙醇中使組織脫水，將脫水組織嵌入到環氧樹脂中，用超微切片機（LKB-5型，瑞典Bromma 公司）切割組織薄片，用醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色。使用透射電子顯微鏡（H-600型，日本日立公司）觀察超微結構變化，計算每個切片的5個隨機視野中空泡化線粒體的百分比［9］。

1.7 細胞凋亡的檢測

在10%緩沖甲醛中將組織固定一夜，將組織嵌入到石蠟塊中，切成5 μm厚的切片，將切片浸入二甲苯中進行脫臘，用梯度乙醇再水化。通過原位細胞凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche Applied Science公司）檢測細胞凋亡情況。根據每個組織切片的5個高倍鏡視野中的凋亡細胞百分比，計算凋亡指數。

1.8 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學處理，數據均以±s表示，組間比較采用方差分析，并進行SNK檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NGAL的表達

對照組中腎小管上皮細胞NGAL表達極低。M0、M1、M2組中NGAL的表達較對照組增加（P＜0.05），但M0、M1、M2組3組間比較無統計學差異（P＞0.05）。M3組與對照組比較NGAL表達明顯增加（P＜0.01），M3組與M0、M1、M2組比較NGAL表達也明顯增加（P＜ 0.05）。S0、S1組中NGAL表達較對照組增加（P＜ 0.05），但S0、S1組2組間比較無統計學差異（P＞ 0.05）。S2、S3組與對照組比較NGAL表達明顯增加（P＜ 0.01），S2、S3組與S0、S1組比較NGAL表達也明顯增加（P＜ 0.05），而S2、S3組2組間比較NGAL表達無統計學差異（P＞ 0.05）。見圖1、表1。

2.2 SOD和MDA的含量

圖1 各組腎組織NGAL表達情況 ×400Fig.1 Renal expression of NGAL in each group × 400

表1 各組腎組織損傷相關指標比較Tab.1 Comparison of the kidney-injury-related indices of the groups

高壓灌注導致腎組織的SOD水平降低，MDA水平升高。M0、M1、M2組中SOD含量較對照組降低（P＜0.05），而MDA含量較對照組增加（P＜ 0.05），但M0、M1、M2組3組間比較無統計學差異（P＞ 0.05）。M3組與對照組比較SOD含量明顯降低（P＜ 0.01），MDA含量明顯增加（P＜ 0.01）；M3組與M0、M1、M2組比較SOD含量明顯降低（P＜ 0.05），MDA含量明顯增加（P＜ 0.05）。S0、S1組中SOD含量較對照組降低（P＜0.05），MDA含量較對照組增加（P＜ 0.05），但S0、S1組2組間比較無統計學差異（P＞ 0.05）。S2、S3組與對照組比較SOD含量明顯降低（P＜ 0.01），MDA含量明顯增加（P＜ 0.01）；S2、S3組與S0、S1組比較SOD含量也明顯降低（P＜ 0.05），MDA含量也明顯增加（P＜0.05）；S2、S3組2組間比較，SOD和MDA含量無統計學差異（P＞ 0.05）。見表1。

2.3 MMP的水平

M0、M1、M2組中MMP水平較對照組降低（P＜0.05），但M0、M1、M2組3組間比較無統計學差異（P＞0.05）。M3組與對照組比較MMP水平明顯降低（P＜0.01），M3組與M0、M1、M2組比較MMP水平也明顯降低（P＜ 0.05）。S0、S1組中MMP表達較對照組降低（P＜ 0.05），但S0、S1組2組間比較無統計學差異（P＞0.05）。S2、S3組與對照組比較MMP水平明顯降低（P＜0.01），S2、S3組與S0、S1組比較MMP水平也明顯降低（P＜ 0.05），而S2、S3組2組間比較MMP水平無統計學差異（P＞ 0.05）。見表1。

2.4 線粒體空泡化比例

電鏡下觀察發現，M0、M1、M2組中線粒體空泡化比例較對照組增高（P＜ 0.05），但M0、M1、M2組3組間比較無統計學差異（P＞ 0.05）。M3組與對照組比較線粒體空泡化比例明顯增高（P＜ 0.01），M3組與M0、M1、M2組比較線粒體空泡化比例也明顯增高（P＜ 0.05）。S0、S1組中線粒體空泡化比例較對照組增高（P＜ 0.05），但S0、S1組2組間比較無統計學差異（P＞ 0.05）。S2、S3組與對照組比較線粒體空泡化比例明顯增高（P＜ 0.01），S2、S3組與S0、S1組比較線粒體空泡化比例也明顯增高（P＜ 0.05），而S2、S3組2組間比較線粒體空泡化比例無統計學差異（P＞ 0.05）。見圖2、表1。

2.5 細胞凋亡指數

圖2 電鏡下觀察各組腎組織腎小管上皮細胞線粒體 ×10 000Fig.2 Mitochondria of renal tubular epithelial cells examined under an electron microscope in each group ×10 000

高壓灌注導致明顯的腎小管細胞凋亡。對照組中可觀察到凋亡細胞極少。M0、M1、M2組中細胞凋亡指數較對照組增高（P＜ 0.05），但M0、M1、M2組3組間比較無統計學差異（P＞ 0.05）。M3組與對照組比較細胞凋亡指數明顯增高（P＜ 0.01），M3組與M0、M1、M2組比較細胞凋亡指數也明顯增高（P＜ 0.05）。S0、S1組中細胞凋亡指數較對照組增高（P＜ 0.05），但S0、S1組2組間比較無統計學差異（P＞ 0.05）。S2、S3組與對照組比較細胞凋亡指數明顯增高（P＜0.01），S2、S3組與S0、S1組比較細胞凋亡指數也明顯增高（P＜ 0.05），而S2、S3組2組間比較細胞凋亡指數無統計學差異（P＞ 0.05）。見圖3、表1。

3 討論

經皮腎鏡、輸尿管鏡等常常需要高壓灌注。本研究結果表明，一定閥值以上的灌注壓力會導致腎氧化損傷；同時，一定程度的腎積水也會導致腎氧化損傷，而腎積水的程度也會影響腎組織對灌注壓力的承受能力，積水重的腎臟更容易在腎盂高壓灌注中受到氧化損傷。

圖3 各組腎組織腎小管上皮細胞凋亡情況 ×400Fig.3 Apoptosis of renal tubular epithelial cells in each group ×400

研究表明，腎盂灌注壓力超過30 mmHg可能會引起腎盂靜脈回流，而經皮腎鏡、輸尿管鏡等手術通常所用的灌注壓力為50～300 mmHg［10］。腎盂靜脈回流增加了靜脈內壓力，腎微血管回流受阻，組織缺血缺氧，從而導致腎臟缺血再灌注損傷。腎靜脈梗阻比腎動脈梗阻導致的損傷更嚴重［11］。

NGAL是急性腎損傷過程中的敏感標志物，在腎損傷后3 h內出現在近曲小管中，在12 h內逐漸釋放到血漿中［12］。本研究中，對輕度積水腎臟施加100 mmHg灌注壓力以及對重度積水腎臟施加60和100 mmHg灌注壓力，均可看到NGAL表達明顯增加。本研究結果表明，積水嚴重的腎臟更容易受到腎盂高壓灌注的損傷。

活性氧是組織損傷的重要介質，活性氧的集聚對細胞的危害極大［13］。SOD是一種抗氧化酶，它能對抗活性氧的損傷作用。所以，本研究將SOD水平作為反映組織抗氧化能力的指標。MDA是腎組織中活性氧作用于脂質導致的過氧化作用的產物，MDA的水平反映了組織中氧化損傷的程度［14］。本研究中，相對于對照組，所有腎積水組的SOD活性都較高，而MDA水平都較低，而輕度腎積水模型施加100 mmHg灌注壓力時，或重度腎積水模型施加60和100 mmHg灌注壓力時，可觀察到SOD活性明顯下降，MDA水平明顯上升。結果表明，積水可導致腎組織出現氧化損傷；積水越重，對腎盂灌注壓力耐受能力越差，更容易在腎盂灌注中出現氧化損傷。

保持MMP的穩定對細胞活性十分重要，MMP下降使得線粒體膜通透性轉換孔開放，小分子流入，導致線粒體腫脹和空泡化，包括細胞色素C等一些凋亡物質被釋放入胞質，觸發細胞凋亡［15］。MMP下降被看作是早期細胞凋亡指標。本研究中，100 mmHg灌注壓力下，輕度腎積水組MMP明顯下降，60和100 mmHg灌注壓力下，重度腎積水組MMP明顯下降，同時在電鏡下觀察到這幾組腎小管上皮細胞線粒體腫脹和空泡化比例明顯增加，這些結果與本研究測得的細胞凋亡指數是一致的。嚴重積水的腎組織在受到高壓腎盂灌注時更容易出現細胞凋亡。

本研究在兔模型上模擬了人體輸尿管鏡和經皮腎鏡手術腎盂灌注的狀態，但現有的動物模型也存在一些局限性：由于腎組織耐受性差異，本研究所用的灌注壓力與人體手術中所用的腎盂灌注壓力在生理上不相關；此外，本研究沒有量化腎積水程度，積水程度可能與人體在手術中的具體情況有所不同。本研究沒有研究灌注導致的某些腎損傷是否可逆，但是本研究結果證實了嚴重積水腎臟比輕度積水腎臟對腎盂灌注壓力耐受性要差。根據這一結果，需進一步研究導致灌注壓力耐受性下降的機制，指導臨床手術中使用最佳腎盂灌注壓力來保持清楚的視野和沖洗結石碎屑，同時防止或減少腎臟的氧化損傷。

綜上所述，腎盂高壓灌注可導致腎損傷，而積水程度越重的腎臟對于腎盂灌注的耐受力越差。