PEDF基因修飾骨髓干細胞對糖尿病心肌梗死大鼠心肌損傷的作用及其對Wnt/β-catenin信號通路的影響

劉宇，石云，張旭，高妍，王歡，王斌

（北部戰區總醫院心血管外科，沈陽 110016）

糖尿病對人類健康造成嚴重的威脅，可引發多種并發癥，其中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary heart disease，CHD）是最嚴重的并發癥之一，而心肌梗死是死亡率最高的并發癥［1］。糖尿病所致的胰島素抵抗及高胰島素血癥致使血管中的大量炎性細胞因子作用于冠狀動脈，加重了冠狀動脈病變，進而使糖尿病合并冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者的死亡風險增大。骨髓干細胞（marrow-derived stem cell，MSC）可以分化成心肌細胞，移植MSC可以取代壞死的心肌細胞，刺激血管新生，進而通過改善心室重塑而改善心功能［2］。色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）是具有多種生物學功能的分泌性糖蛋白，在機體多種組織中均有表達，在心肌組織中高表達［3］。PEDF作為抗新生血管分子，其活性要強于其他的抗新生血管因子［4］。PEDF可以抑制血管內皮細胞的移行和增殖［5-6］，影響他們的生物學行為，繼而有可能在多種心血管疾病的病理過程中發揮重要作用。Wnt/連環蛋白（β-catenin）信號通路參與血管內皮損傷及血管重塑等重要病理生理活動，在心血管疾病的發生發展中發揮重要作用［7-8］。本研究通過構建糖尿病大鼠心肌梗死模型，探討沉默PEDF基因的MSC對糖尿病大鼠心肌梗死的作用及其對Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的影響，旨在為糖尿病合并心肌梗死的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級SD雄性大鼠40只，體質量350～450 g，由北部戰區總醫院實驗動物科提供，并由北部戰區總醫院實驗動物倫理委員會審查通過。采用隨機數字表法分為4組：糖尿病組（DM組）、糖尿病心肌梗死組（DMI組）、移植PEDF-/MSC的糖尿病心肌梗死組（PM組，造成心肌梗死后移植50 μL PEDF-/MSC，注射于心肌梗死周邊2點）及注射Wnt/β-catenin抑制劑并移植 PEDF-/MSC的糖尿病心肌梗死組［WPM組，造成心肌梗死后轉移50 μL PEDF-/MSC，注射于心肌梗死周邊2點，30 min后靜脈注射HY-15597（8 mg/kg）］，每組10只。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠心肌梗死模型建立：大鼠飼喂高糖高脂飼料8周，腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液（65 mg/kg），72 h后檢測血糖，血糖≥16.7 mmol/L即造模成功。將造模成功的糖尿病大鼠麻醉后連接小動物心電圖機，氣管插管，將大鼠左側第4肋間中線處橫切開，剪開心尖搏動最明顯處的肋間肌，找到前降支，結扎冠狀動脈。心肌顏色變白，心電圖示ST段抬高判定為心肌梗死模型制作成功。

1.2.2 樣本采集：大鼠術后24 h靜脈取血（5 mL），4周后彩超采集數據后將大鼠麻醉置管，經右頸內靜脈取血（5 mL），離心法分離出血清，-80 ℃保存待測；同時立即取心臟組織，一半置于-80 ℃冰箱保存待測；另一半置于甲醛中浸泡。

1.2.3 心功能檢測：移植后4周，各組大鼠進行心臟超聲檢查來評估心功能。圖像采集在左心室短軸乳頭肌平面行M型超聲檢查，測量計算左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）；抽 取 血液送檢，采用全自動血液生化檢測儀檢測肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶MB（creatine kinase-MB，CK-MB）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）水平。

1.2.4 HE染色：將甲醛中固定的組織樣本分別置于不同濃度（70%、80%、90%、95%、100%）乙醇中，二甲苯透明，浸蠟、包埋成蠟塊，切片機器切片（4 μm）后脫蠟，蘇木精染色（5 min），PBS清洗，1%鹽酸乙醇分化，伊紅染液30 s，梯度乙醇脫水、透明處理，中性樹膠封片，光鏡下觀察各組大鼠心肌組織的病理變化。

1.2.5 免疫熒光檢測血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）：將心肌組織蠟塊切片脫蠟至水后，浸于3%過氧化氫溶液15 min后，PBS清洗切片，枸緣酸鈉溶液修復抗原；山羊血清封閉，37 ℃孵育30 min，傾去血清，勿洗，加入VEGF（ab32152，美國Abcam公司）、胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）；ab39398，美國Abcam公司），PDGF B（ab181341，美國Abcam公司）抗體，4 ℃孵育過夜；PBS清洗切片，加入熒光標記的二抗，37 ℃孵育30 min后PBS清洗切片，加入DAPI染細胞核，室溫孵育10 min，PBS清洗切片，中性樹膠封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 Western blotting檢測 Wnt/β-catenin 通路相關蛋白的表達：將心肌組織及細胞勻漿后，加入預冷的RIPA（89900，美國Thermo公司）裂解液，冰上裂解30 min，收集上清液，使用BCA（23225，美國Thermo公司）蛋白定量試劑盒對收集的蛋白液進行濃度測定，SDS-PAGE電泳蛋白后進行轉膜，加入wnt3a（ab219412，美國Abcam公司），β-catenin（ab16051，美國Abcam公司）及survivin（ab469，美國Abcam公司）一抗，4 ℃孵育過夜，PBS清洗PVDF膜后，加二抗，室溫孵育2 h后ECL發光試劑盒顯色，凝膠成像系統成像，Quantity One軟件讀取灰度值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計量資料采用±s表示，組間比較采用方差分析，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能情況比較

結果顯示，在MSC移植4周后，DM組、DMI組、PM組、WPM組LVEF分別為（69.48±5.23）%、（42.31±4.40）%、（61.52±2.15）%、（45.32±3.98）%。DMI組LVEF較DM組明顯降低（P＜ 0.05）；而PM組LVEF較DMI組明顯升高（P＜ 0.05），WPM組LVEF較PM組降低（P＜0.05）。

術后24 h CK、CK-MB、BNP水平檢測結果顯示，DMI組CK、CK-MB、BNP明顯高于DM組（P＜ 0.05），PM組較DMI組明顯降低（P＜ 0.05），WPM組較PM組則明顯增高（P＜ 0.05）。術后4周CK、CK-MB、BNP水平檢測結果顯示，與24 h 結果比較，DMI組和PM組各項指標均下降（P＜ 0.05）；與DMI組比較，PM組各項指標下降更顯著（P＜ 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠心肌組織HE染色結果

結果顯示，DM組心肌細胞排列比較規則，心肌細胞邊界較清晰、細胞核完整；DMI組心肌細胞分布大量炎癥細胞，未見完整的心肌細胞形態，心肌肌橫紋嚴重破壞，肌纖維斷裂、溶解、壞死，心肌細胞間質充血水腫，間隙明顯増大，局部有炎癥細胞浸潤；PM組心肌細胞改善，損傷程度好轉，心肌細胞形態尚完整，肌纖維排列有序，心肌組織充血、腫脹減輕。WPM組心肌組織形態同DM組相似，存在大量炎癥細胞，細胞形態不完整，細胞間質水腫，間隙增大。見圖1。

表1 各組大鼠CK、CK-MB、BNP水平比較Tab.1 Comparison of CK，CK-MB，and BNP levels in rats in each group

2.3 各組大鼠VEGF、IGF-1、PDGF B表達比較

免疫熒光檢測結果顯示，與DM組比較，DMI組大鼠VEGF、IGF-1、PDGF B的表達明顯減少（P＜0.05）；與DMI組比較，PM組VEGF、IGF-1、PDGF B表達明顯增加（P＜ 0.05）；與PM組比較，WPM組VEGF、IGF-1、PDGF B表達明顯減少（P＜ 0.05）。見表2、圖2。

2.4 各組大鼠Wnt/β-catenin通路相關蛋白的表達

Western blotting檢測結果顯示，DMI組心肌組織Wnt3a、β-catenin、survivin表達較DM組明顯增加（P＜0.05）；PM組心肌組織Wnt3a、β-catenin、survivin表達較DMI組明顯降低（P＜ 0.05）；WPM組心肌組織Wnt3a、β-catenin、survivin表達與DMI組比較無統計學差異（P＞ 0.05）。見表3、圖3。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色結果 ×200Fig.1 HE staining of myocardial tissue from rats in each group ×200

表2 各組大鼠VEGF、IGF-1、PDGF B表達的比較Tab.2 Comparison of VEGF，IGF-1，and PDGF B expression in rats in each group

圖2 各組大鼠VEGF、IGF-1、PDGF B表達情況 ×200Fig.2 Expression of VEGF，IGF-1，and PDGF B in each group ×200

3 討論

已有研究［9-11］證明，成人MSC是心肌梗死細胞治療的重要來源，MSC可能通過旁分泌機制發揮治療作用，即分泌多種細胞因子來促進血管新生、抗凋亡、抗纖維化，改善心室重塑，進而改善心臟功能。前期的研究［12］發現糖尿病可能會抑制MSC治療心肌梗死的效果，但其原因和機制不明。本研究建立糖尿病大鼠心肌梗死模型，檢測大鼠心功能，血管生成因子及Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白，探究沉默PEDF的MSC對糖尿病大鼠心肌梗死的發生和進展過程中的作用。

作為一種多潛能干細胞，MSC可以誘導分化為多種細胞（心肌細胞和內皮細胞等［13］）。以往多項研究［3，13-14］表明MSC可以分泌血管新生相關因子，血管新生相關因子在心肌梗死治療中發揮作用。研究［9-11］表明，移植后的MSC可以分泌多種因子，包括VEGF、IGF、PDGF、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），基質細胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1），堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），白細胞介素-1（interleukine-1，IL-1）。這些因子通過促進血管新生、細胞存活，移植心室重塑等來改善心臟功能［9-10］。也有研究［9-11］發現，PEDF是已知功能最強大的抑制新生血管因子，它可以持續活化誘導血管內皮細胞的凋亡，與心肌梗死后心肌損傷關系密切。本研究發現沉默PEDF的MSC可以顯著上調VEGF、IGF-1、PDGF B的表達，提示沉默PEDF的MSC可以減輕糖尿病大鼠心肌梗死的心肌損傷程度，改善心功能，其作用機制可能與其上調VEGF、IGF-1、PDGF B表達有關。

表3 各組大鼠Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的比較Tab.3 Comparison of the expression of the Wnt/ beta-catenin pathway-related proteins in rats in each group

圖3 Western blotting檢測各組大鼠Wnt/β-catenin通路相關蛋白的表達Fig.3 The expression of proteins related to the Wnt/β-catenin pathway in each group by Western blotting

Wnt/β-catenin信號通路是參與胚胎和器官發育的主要信號傳導途徑之一。Wnt家族基因主要編碼分泌型信號蛋白，與腫瘤發生、脂肪形成有關。此外，它還參與調節胚胎發育過程中的細胞分化。Wnt3a是Wnt家族的一員，有研究［15］發現Wnt3a、Wnt5a在心肌肥大小鼠心肌細胞中表達上升，并且可能與心肌細胞凋亡有關。還有研究發現Wnt3a可以抑制小鼠心臟側群干細胞的增殖，阻斷內源性心肌細胞再生，損傷心臟功能。survivin是凋亡抑制蛋白分子家族之一［7］。有研究發現survivin在心肌細胞中可以促進DNA合成，改善細胞周期進程［8，15］。并且己有研究［16］證實在DOX誘導的心力衰竭大鼠模型靜脈注射survivinDNA質粒可以改善左心室收縮功能障礙，有望成為基因治療的重要靶點。

本研究以糖尿病心肌梗死大鼠心肌損傷模型為研究對象，探討PEDF對大鼠心肌損傷的機制，研究發現沉默PEDF的MSC可以顯著下調心肌組織Wnt3a、β-catenin、survivin表達，而加入抑制劑后，這種下調作用顯著被抑制，提示沉默PEDF的MSC可以通過下調Wnt3a、β-catenin、survivin表達來抑制血管內皮損傷，從而減輕糖尿病大鼠心肌梗死后心功能損傷。

綜上所述，沉默PEDF的MSC可以減輕糖尿病大鼠心肌梗死的心肌損傷程度，改善心功能；其作用機制可能是通過調控Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達抑制血管內皮損傷來實現的。