運動調控TSLP對高脂飲食下葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠潰瘍性結腸炎的作用及機制

鄧秋萍，劉維新，來爽，蘭雨桐，陳軼楠，楊美琪，梁增，李雪梅

（中國醫科大學附屬第一醫院消化內科，沈陽 110001）

炎癥性腸病是一種以腹痛、腹瀉為主要癥狀的慢性復發性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病，其發病機制尚未明確，且目前尚無針對性的特效療法。近年來，我國炎癥性腸病的患病率和發病率呈上升趨勢，可能和我國經濟發展、人們飲食習慣西式化改變密切相關［1］。其中高脂飲食導致的肥胖，通過脂類在消化道的代謝產物損傷腸道微環境，誘發結腸黏膜炎癥［2-3］。

本課題組前期研究［4］發現，自主運動可以通過上調糖皮質激素介導的過氧化物酶體增殖物激活受 體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）來減輕腸道炎癥，但是具體機制尚未明確。胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）是一類上皮細胞合成的細胞因子，有研究［5-6］發現TSLP基因在肥胖人群及小鼠中表達減少，TSLP下降在一定程度上加重了腸道炎癥。但是TSLP在炎癥性腸病中的促炎和抑炎作用尚存在爭議，有研究［7］發現腸道黏膜中的炎癥通過促炎因子Th2觸發腸道上皮細胞釋放TSLP，導致潰瘍性結腸炎惡化，然而大多數研究［8-9］認為TSLP在炎癥性腸病中表現為抗炎作用。本研究擬通過建立小鼠運動模型，并予以高脂飲食、PPAR-γ抑制劑（GW9662）及PPAR-γ激動劑（吡格列酮）等藥物處理，采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）建立小鼠潰瘍性結腸炎，進一步探討TSLP在潰瘍性結腸炎中的作用及機制，為臨床治療和預防提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用雄性6～8周齡Balb/c小鼠80只，體質量24～27 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，自由飲食水，適應性喂養1周，恒溫（23±2）℃，恒濕50%±10%，晝夜循環。

1.2 材料

分子量（36～50）×103的DSS，購自美國MP-BIO公司。GW9662購自美國MCE公司，吡格列酮購自北京索萊寶科技有限公司。小鼠白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β及TSLP 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒，購自上海滬宇生物科技有限公司。Trizol、cDNA反轉錄試劑盒及PCR試劑盒，均購自日本Ta-KaRa公司。引物序列由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。高脂飼料：基礎飼料+15%豬油+15%蔗糖，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。其余材料均為實驗室自備。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組：適應性喂養1周后，將隨機小鼠分為靜止（sedentary，SED）對照組、SED+DSS組、SED+GW9662+DSS組、SED+吡格列酮+DSS組、運動（exercise，EXE）對照組、EXE+DSS組、EXE+GW9662+DSS組、EXE+吡格列酮+DSS組，每組10只。小鼠予高脂飲食，自由飲食水，各運動組小鼠每天在跑步機上運動40 min，余靜止組不做運動處理，SED+GW9662+DSS組及EXE+GW9662+DSS組小鼠予GW9662（隔天1 mg/kg）腹腔注射，SED+吡格列酮+DSS組及EXE+吡格列酮+DSS組予吡格列酮（每日10 mg/kg）灌胃處理。30 d運動周期結束后，除SED對照組及EXE對照組外，其余各組小鼠均予3% DSS水自由飲用7 d，每天更換新鮮配置的DSS水。

1.3.2 疾病活動指數（disease activity index，DAI）的評估：自建模起每日觀察并記錄小鼠造模后的精神狀態、運動、進食情況及毛發數量、密度以及光澤，定時稱量小鼠體質量，觀察大便性狀和便血情況（四甲基聯苯胺法）。DAI=體質量下降分數+大便性狀分數+便血分數。評分標準包括體質量下降百分率（＜1%為0分，1%～＜5%為1分，5%～＜10%為2分，10%～＜15%為3分，≥15%為4分）、大便黏稠度（正常為0分，松散大便為2分，腹瀉為4分）和大便出血（正常為0分，隱血陽性為2分，顯性出血為4分）。計算總評分，以評估疾病活動情況。

1.3.3 標本采集：于造模結束后禁食24 h，采用頸椎脫臼法處死小鼠。處死前自由飲用水1 h，采用摘眼球法取血，放入EP管中，靜置2 h后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取血清-80 ℃冰箱保存備用。將每只小鼠整段結腸取出，沿縱軸切開，用PBS沖凈后明確炎癥部位，截取1 cm組織固定于10%甲醛溶液中，常規石蠟包埋、制作組織切片、HE染色后封片，光鏡下觀察結腸組織病理改變的情況，余組織快速置于液氮中，轉至-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.4 組織病理學損傷及評分：在光鏡下觀察結腸組織切片。組織病理評分標準：上皮組織無損傷破壞，無炎癥浸潤，0分；少量杯狀細胞破壞，浸潤至隱窩基底周圍，各1分；廣泛杯狀細胞破壞，浸潤至黏膜肌層，各2分；廣泛杯狀細胞破壞及少量腺體破壞，黏膜肌層廣泛浸潤并水腫增厚，各3分；大量腺體消失，浸潤至黏膜下層，各4分。合計總分，評估組織損傷情況。

1.3.5 ELISA法檢測血清中IL-6、IL-1β及TSLP表達情況：取小鼠血清，充分解凍后，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-6、IL-1β及TSLP表達情況。

1.3.6 實時PCR法檢測組織中PPAR-γmRNA表達水平：取適量結腸組織，Trizol提取結腸組織總RNA，利用cDNA反轉錄試劑盒將其反轉錄合成cDNA，并將合成的cDNA為模板進行實時PCR檢測。PPAR-γ正反引物序列分別為5’-GCCTCCCTGATGAATAAAGA TG-3’和5’-AGGCTCCATAAAGTCACCAAAG-3’。反應 體 系 中 包 含1 μL的cDNA，5 μL的SYBR Premix，0.4 μL的上下游引物各一個，3.2 μL去離子水。置于LCS480系統進行PCR，反應條件：95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s增殖，共進行40個循環，95 ℃ 10 s，65 ℃ 10 s，95 ℃溶解曲線，40 ℃ 30 s冷卻。記錄目的基因和內參基因的Ct值，采用相對定量的方法（2-△△Ct法）計算PPAR-γmRNA相對表達量。

1.4 統計學分析

采用SPSS 24.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示。2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況及DAI

開始造模時，小鼠體質量上升明顯，15 d后體質量逐漸趨于恒定。見圖1A。30 d運動及藥物處理結束后，在小鼠飲用水中加或不加3%DSS，自由飲用7 d（即造模第31～37天）。其中飲用水中未加DSS的SED對照組及EXE對照組小鼠體質量無明顯變化，余各組小鼠體質量從造模第35天（即加入DSS第5天）均開始下降，其中SED+GW9662+DSS組、EXE+GW9662+DSS組小鼠體質量下降明顯。見圖1B。

圖1 各組小鼠體質量變化情況Fig.1 Changes in body weight for each group of mice

加入DSS后，開始時小鼠精神、毛發及飲食狀態良好，體質量在造模第35天（加入DSS后第5天）開始下降；從造模第33天（加入DSS后第3天）開始小鼠逐漸出現大便隱血弱陽性，從第35天開始，小鼠出現精神倦怠、黏液便及隱血陽性，SED+GW9662+DSS組小鼠開始出現便血等。但飲用水中未知DSS的SED對照組及EXE對照組小鼠運動、飲食及精神狀態良好，大便正常，為成形顆粒便。SED對照組和EXE對照組小鼠DAI無明顯變化；與SED對照組比較，SED+DSS組、SED+GW9662+DSS組、SED+吡格列酮+DSS組DAI明顯增加，與EXE對照組比較，EXE+DSS組、EXE+GW9662+DSS組及EXE+吡格列酮+DSS組DAI明顯增加，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠DAI變化情況Fig.2 Changes in DAI for each group of mice

2.2 結腸組織病理學情況

光鏡下看，SED對照組及EXE對照組可見少量白細胞浸潤；SED+DSS組炎癥浸潤至隱窩基底周圍，少量杯狀細胞破壞，EXE+DSS組可見明顯炎癥浸潤至黏膜肌層，少量腺體破壞；SED+GW9662+DSS組見廣泛杯狀細胞破壞及少量腺體破壞，黏膜肌層廣泛浸潤并水腫增厚，EXE+GW9662+DSS組見大量腺體消失，浸潤至黏膜下層；SED+吡格列酮+DSS組見大量腺體消失，黏膜肌層廣泛浸潤，EXE+吡格列酮+DSS組見大量腺體消失，浸潤至黏膜下層。見圖3。各組小鼠結腸組織病理學評分結果可見，各運動組小鼠組織病理學評分均高于對應的靜止組，其中SED+GW9662+DSS組和SED對照組、EXE+GW9662+DSS組和EXE對照組、SED+DSS組和EXE+DSS組、SED+GW9662+DSS組和EXE+GW9662+DSS組比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表1。

2.3 血清中IL-6、IL-1β及TSLP表達情況

圖3 各組小鼠光鏡下結腸組織病理圖片 ×100Fig.3 Pathological picture of colon tissue under a microscope for each group of mice ×100

表1 各組小鼠結腸組織病理學評分及血清中IL-6、IL-1β和TSLP的表達水平Tab.1 Histopathological scores in colon tissues and the levels of IL-6，IL-1β，and TSLP in serum from each group of mice

2.3.1 IL-6表達：各運動組血清IL-6表達均高于對應的靜止組，差異均有統計學有意義（P＜ 0.05）；與SED對 照 組 比 較，SED+GW9662+DSS組 及SED+吡格列酮+DSS組表達升高，與EXE對照組比較，EXE+吡格列酮+DSS組表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；且SED+GW9662+DSS組低于SED+吡格列酮+DSS組，EXE+GW9662+DSS組低于EXE+吡格列酮+DSS組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表1。

2.3.2 IL-1β表達：各運動組血清IL-1β表達均高于對應的靜止組，其中SED+GW9662+DSS組和EXE+GW9662+DSS組比較，差異有統計學有意義（P＜0.05），其余差異無統計學意義（P＞ 0.05）；與SED對照組比較，SED+DSS組、SED+GW9662+DSS組及SED+吡格列酮+DSS組表達均升高，但差異無統計學意義（P＞ 0.05）；與EXE對照組比較，EXE+DSS組、EXE+GW9662+DSS組及EXE+吡格列酮+DSS組表達均升高，其中EXE對照組和EXE+GW9662+DSS組比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05），其余差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表1。

2.3.3 TSLP表達：各運動組血清TSLP表達均低于對應的靜止組，除對照組外，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。SED+GW9662+DSS組 及SED+吡 格 列酮+DSS組低于SED對照組，EXE+GW9662+DSS組及EXE+吡格列酮+DSS組低于EXE對照組，SED+吡格列酮+DSS組低于SED+GW9662+DSS組，EXE+吡格列酮+DSS組低于EXE+GW9662+DSS組，但差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表1。

2.4 結腸組織中PPAR-γmRNA表達情況

實時PCR法檢測各組結腸組織中PPAR-γmRNA表 達，EXE對 照 組（2.36±0.01）與 SED對 照組（1.00±0.00）相比、EXE+DSS組（1.53±0.14）與SED+DSS組（1.00±0.00）相比、EXE+GW9662+DSS組（21.79±5.94）與SED+GW9662+DSS組（1.00±0.00）相比、EXE+吡格列酮+DSS組（4.23±0.19）與SED+吡格列酮+DSS組（1.00±0.00）相比表達升高，差異均有統計學意義（P＜ 0.05），其中EXE+GW9662+DSS組升高最為顯著。

3 討論

近年來，我國炎癥性腸病呈現出發病率急劇上升、年輕化趨勢明顯、漏診率和誤診率高的特點，目前炎癥性腸病的病因和發病機制尚未明確。由于疾病的特殊性、持續性、復發性，盡管目前有很多新型藥物投入使用，但炎癥性腸病的治療仍是一個亟待解決的難題。我國炎癥性腸病發病率升高，考慮與飲食習慣、生活習慣的改變息息相關。

適度運動可以提高免疫功能，抗炎和預防炎癥疾病。本課題組前期研究［4］發現，自主運動可以減輕高脂飲食下DSS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎。此外，ALLEN等［10］研究發現，自主運動通過改變腸道微生物群減輕DSS誘導的小鼠腸道炎癥，主要表現在減少結腸縮短，減少黏液消耗以及增加組織再生中涉及的細胞因子的表達來減輕腸道炎癥，而強迫運動會加劇腸道炎癥。MAZUR-BIALY等［11］證明了自主運動通過釋放保護性鳶尾素、恢復血漿脂聯素來減輕高脂飲食誘導的小鼠結腸損傷，并且發現高脂飲食加重小鼠腸炎可能與結腸微環境下降以及血漿中促炎標志物和腸系膜脂肪含量增加相關。此外，DEFILIPPIS等［12］將250例炎癥性腸病患者納入研究，記錄運動情況、疾病活動情況、炎癥標志物以及臨床表現，發現患者可能從運動中受益，但是由于炎癥性腸病復發和緩解的性質以及有患者在常規運動中受到障礙，仍需更大的樣本來論證。本研究中，小鼠在跑步機上運動屬于被動運動，結果發現運動組小鼠在飲用水中加入DSS后DAI逐漸上升，光鏡下觀察結腸組織病理情況，結果發現各運動組小鼠結腸組織病理表現及評分均高于對應的靜止組，其中SED+GW9662+DSS組和SED對照組、EXE+GW9662+DSS組 和EXE對 照 組、SED+DSS組和 EXE+DSS 組、SED+GW9662+DSS組 和 EXE+GW9662+DSS組比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。各運動組血清IL-6表達均高于對應的靜止組，且差異有統計學有意義（P＜ 0.05）；與SED對照組比較，SED+GW9662+DSS組及SED+吡格列酮+DSS組IL-6表達升高，與EXE對照組比較，EXE+吡格列酮+DSS組IL-6表達升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；且SED+GW9662+DSS組IL-6表達低于SED+吡格列酮+DSS組，EXE+GW9662+DSS組IL-6表 達 低 于EXE+吡格列酮+DSS組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。各運動組血清IL-1β表達均高于對應的靜止組，其中SED+GW9662+DSS組 和EXE+GW9662+DSS組比較，差異有統計學有意義（P＜ 0.05），其余差異無統計學意義（P＞ 0.05）；與EXE對照組比較，EXE+GW9662+DSS組IL-1β表達升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。從各組小鼠DAI、結腸組織病理情況、血清IL-6和IL-1β表達的差異情況，表明運動加重了小鼠腸道炎癥，考慮可能和被動運動改變了小鼠的生理習性等相關，并且 PPAR-γ抑制劑（GW9662）和激動劑（吡格列酮）均加重了小鼠腸道炎癥，其中加入激動劑的小鼠炎癥加重更為顯著，提示PPAR-γ可能是運動介導腸道炎癥改變的重要因素。

TSLP主要由上皮細胞合成分泌，目前國內外對TSLP的研究主要對各種變應性疾病如哮喘、特應性皮炎、慢性阻塞性肺疾病等，甚至是癌癥，但是對炎癥性腸病的研究不多并且存在爭議［13］。已有研究［14］發現，與在過敏性疾病中的作用不同，TSLP在炎癥性腸病中起抗炎作用，TSLP在潰瘍性結腸炎患者中表達減少，對潰瘍性結腸炎患者有保護作用。并且有研究敲除了小鼠TSLP基因，發現在DSS誘導結腸炎過程中炎癥沒有惡化，但是疾病恢復受到TSLP/TSLP受體信號通路的阻礙，明確TSLP在炎癥性腸病中的保護作用［8］。這與本研究結果相同，本研究發現在炎癥較輕的各靜止組小鼠血清中TSLP表達較炎癥較重的運動組高，提示TSLP在潰瘍性結腸炎中起保護作用。

TSLP在炎癥性腸病中主要由短鏈TSLP發揮抗炎作用。有研究［15］發現，結腸中短鏈TSLP受到PPAR-γ調控。本研究試圖證明運動調控TSLP的機制及對腸道炎癥的影響，建立了運動后DSS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎模型。結果發現，血清中TSLP表達各運動組均低于對應的靜止組，除對照組外，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；SED+GW9662+DSS組及SED+吡格列酮+DSS組低于SED對照組，EXE+GW9662+DSS組及EXE+吡格列酮+DSS組低于EXE對照組，SED+吡格列酮+DSS組低于SED+GW9662+DSS組，EXE+吡格列酮+DSS組低于EXE+GW9662+DSS組，但差異無統計學意義（P＞ 0.05）。以各靜止組為對照，對應的運動組PPAR-γmRNA表達均相對升高（P＜ 0.05），其中EXE+GW9662+DSS組升高最為顯著。TSLP可能作為抑炎因子在腸道起保護作用，在運動組中TSLP表達均高于相應的靜止組，考慮與運動上調PPAR-γ從而下調TSLP有關。本研究發現，和對照組比較，使用PPAR-γ抑制劑和激動劑的小鼠血清中TSLP表達均較低，并且使用激動劑的小鼠TSLP表達更低，表明TSLP的表達受PPAR-γ的調控。

綜上所述，本研究發現運動通過上調PPAR-γ下調TSLP從而加重腸道炎癥，TSLP在潰瘍性結腸炎中起抗炎作用，可能成為治療的新靶點。