PGG通過激活Nrf2抗氧化通路保護AGEs誘導的系膜細胞損傷※

●童金枝 朱甜甜 徐夢強 金 勇 張紅燕 孫 敏

1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-O-galloy-β-D-glucose,PGG)是一種多酚類水溶性鞣質，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥等多種生物學活性，廣泛存在于多種藥用植物中[1-2]。本實驗室前期研究表明PGG可以結合系膜細胞[3]，但是其對系膜細胞損傷的保護機制尚不清楚。

AGEs（advanced glycation end products,AGEs）是由小分子葡萄糖上的醛基和大分子蛋白質上的還原氨基在非酶環境下產生的非常穩定且不可逆晚期糖基化終末產物[2]，糖尿病高血糖狀態下，AGEs 產生異常增加并誘導細胞產生一系列級聯性的氧化應激反應，是糖尿病及其并發癥發生、發展的主要機制[4]。Nrf2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2)信號通路是一條抗氧化通路，其被激活后可啟動多種下游靶蛋白如HO-1(hemeoxygenase-1,HO-1)、SOD(Superoxide dismutase,SOD)的表達[5]。這些被激活的靶蛋白可調節機體內氧化還原平衡，使機體從氧化狀態恢復到正常水平狀態[6]。

本實驗將以AGEs 誘導腎小球系膜細胞損傷模型，從Nrf2/HO-1信號通路探討PGG對小鼠腎小球系膜損傷細胞的保護作用及其機制。

1 材料

1.1 細胞株小鼠腎小球系膜MES 13（mouse mesangial cell）細胞株購自美國ATCC細胞庫。

1.2 藥物和試劑PGG（純度≥98%）（批號：BZP1001）購自合肥博美生物科技公司；兔GAPDH多克隆抗體（批號：BA2913）購自博士德生物技術公司、兔Nrf2多克隆抗體(批號：16396-1-AP)、兔Ho-1多克隆抗體（批號：10701-1-AP）、兔Histon-H3 多克隆抗體(批號：17168-1-AP)均購自Proteintech 公司、βactin單克隆抗體（批號：M52007M）購自Abmart公司；MDA(批號：A003-1)和T-SOD（批號：A001-1）測試盒均購自南京建成生物工程研究所；RIPA 蛋白裂解液（批號：P0013B）購自碧云天生物技術公司；雙氯熒光黃乙酸乙酯（DCFH-DA）（批號：4091-99-0）購自SIGMA 公司；胰蛋白酶（批號：825J041）購自上海生工；高糖DMEM（批號：AE27193275）培養基購自Hyclone 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：Pro#NCI3225CH）和ECL發光液(批號：Prod#34095）購自Thermo 公司；小牛血清（fetal bovine serume,FBS）（批號：F8240-100）購自Solarbio 公司；牛血清白蛋白（bovine serum alumin,BSA）（批號：NA0332）購自Bomei公司，其余均為國產分析純試劑。

1.3 儀器低溫離心機（Centrifuge 5417R）德國eppendorf）；低速離心機（SC-04）安徽中科中佳科學儀器有限公司；SynergyH1 全功能酶標儀，美國Biotek儀器有限公司；5100B 可見紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；搖床（TS-1），海門市其林貝爾儀器制造有限公司；JS-1070P化學發光成像系統，上海培清科技有限公司；電轉模儀及電泳儀裝置，上海天能科技有限公司；二氧化碳培養箱（CO-150），美國New Brunswick Scientific CO.,lnc。

2 方法

2.1 AGEs 制備將20mM 葡萄糖和40%BSA 溶于0.15mol/L磷酸鹽緩沖液中，37°C 避光孵育8周，用時用培養基稀釋至所需濃度。

2.2 PGG 制備將PGG 溶于DMSO 中使其終濃度為20mM 的母液，再用PBS 稀釋為400μM 的工作液使用。

2.3 實驗分組及藥物處理用含有10%FBS 高糖DMEM 培養細胞，將其置于37℃含5%CO2 的恒溫培養箱中培養。0.25%胰酶-EDTA消化傳代，接種到細胞培養瓶中用于實驗。選取狀態良好，融合至80%左右的細胞用于實驗，實驗分為五組。正常對照組(Ctrl)：含10%FBS DMEM 培養48h；模型組(AGEs)：含終濃度為30μg/ml 的AGEs 的DMEM 培養基培養；給藥組：含終濃度為30μg/ml 的AGEs 的DMEM 培養基中分別加入終濃度為分別為5μM (PGG-L)、10μM(PGG-M)、和20μM的PGG(PGG-H)，細胞共培養48h。

2.4 指標檢測

2.4.1 細胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量測定[3]MES(150μL 含5×103)接種于96 孔板中，細胞貼壁后，去上清加不同濃度PGG 處理，每組設3個復孔。24h后，棄去培養基，將培養板用預冷的PBS洗滌三次，并在含有DCFH-DA（10μM）的DMEM(不含酚紅)中溫育30min，然后用預冷的PBS洗滌細胞并用不含酚紅的100μLDMEM 覆蓋。置酶標儀于激發光485nm發射光530nm檢測熒光強度。

2.4.2 MDA 含量和SOD 活力測定 MES 以1.8×104個密度接種于24 孔板中，細胞貼壁后加不同濃度的PGG 處理。24h 后，吸取細胞培養上清，按照說明書檢測MDA含量和SOD活力。

2.4.3 分離細胞漿和細胞核[7]細胞按照上述方法分組處理后，用冰PBS 洗三次，收集細胞，200g 離心3min，棄上清加冷PBS，200g 離心10min，加低滲Buffer[含10mMHEPES（pH7.8）、10mM KCL、2mMMgCl、0.1mMEDTA、10mM Na2P2O4、1mM NaF、10mM β-glycerephosphate、3mMPMSF]，室溫2min 冰上10min，加10%NP-40手指輕彈，500g離心5min，取80%上清即為胞漿蛋白；棄去剩下20%上清，用含10%NP-40的低滲Buffer 將底部沉淀（含少量胞漿的細胞核）洗三遍，加 入 高 鹽Buffer[ 含50mMHepes、50mMKCl（pH7.4）、300mMNaCl、0.1mM EDTA、10%(V/V)甘油、10mM Na4P2O4、1mM NaF、10mM β-甘油磷酸、3mM PMSF]，并置于液氮中反復凍融三次，置冰上20min，20000g離心20min，取上清即為胞核蛋白。胞漿和胞核蛋白分別用BCA 試劑盒檢測蛋白含量，蛋白含量調一致。

2.4.4 Western blot 法檢測蛋白的表達 細胞按照上述方法分組處理后，冰PBS 洗三次，收集細胞，3000r/min 離心3min，棄去上清，加入適量RIPA 裂解液，置于冰上，超聲裂解提取蛋白，12000r/min 離心20min，保留上清，BCA 法測定蛋白濃度，將蛋白濃度調節一致，加入上樣緩沖液，加熱煮沸5min，制成樣品。樣品經12%SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白電轉移至NC 膜，0.5%脫脂牛奶封閉1h，PBST 洗三次，一抗4℃冰箱孵育過夜，再用PBST 洗三次，室溫二抗孵育2h，PBST 洗三次，ECL 顯色液，JS-1070P 化學發光成像系統拍照保存，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.4.5 統計學分析 采用GraphPadPrism5.0統計軟件進行數據分析。數據以平均值±標準誤（χ±SE）表示各組之間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)進行檢驗，P＜0.05認為有顯著性差異。

3 結果

3.1 AGEs 對Nrf2、HO-1 蛋白表達時效關系結果如圖1 所示，與0h 比較，AGEs 刺激2-6hMES 細胞中Nrf2、HO-1 蛋白表達量增加，12-72hMES 細胞中Nrf2、HO-1表達水平逐漸降低。AGEs孵育48h，MES細胞中Nrf2和HO-1蛋白表達量較對照組顯著下降，且趨于穩定，因此選用AGEs 處理48h 作為實驗模型組。

圖1 AGEs不同處理時間段對MES細胞中Nrf2和HO-1表達的影響

3.2 PGG對AGEs刺激的MES全細胞中Nrf2及HO-1蛋白表達的影響結果如圖2 所示，與Ctrl 組相比較，模型組Nrf2、HO-1蛋白表達量顯著下降（P＜0.001，P＜0.05）。與AGEs組相比較，5、10、20μMPGG組Nrf2 蛋白表達量呈現劑量依賴式增加，差異具有顯著性意義(P＜0.05，P＜0.001)，表明一定范圍內PGG濃度越高，Nrf2 蛋白表達量越高。5、10μM PGG 組HO-1蛋白表達量較AGEs組相比增加但差異并無顯著性意義（P＞0.05），而20μM PGG 組HO-1 蛋白表達量較AGEs組顯著增加(P＜0.01)。

圖2 PGG對MES全細胞中Nrf2及HO-1蛋白表達的影響

3.3 PGG 對AGEs 孵育MES 細胞胞漿和胞核中Nrf2蛋白表達的影響結果如圖3所示，與Ctrl組相比，模型組胞漿、胞核中Nrf2 表達量均顯著降低（P＜0.05），5、10μM PGG 劑量組Nrf2 蛋白表達略有降低，但無顯著性意義（P＞0.05），二20μM PGG組Nrf2表達較模型組顯著升高（P＜0.05）；5、10、20μM PGG 處理使細胞核中Nrf2 蛋白表達量顯著增加，且呈劑量依賴方式。

圖3 PGG對MES胞漿及胞核中Nrf2蛋白表達的影響

3.4 PGG 對AGEs 刺 激 的MES 細 胞 中ROS、MDA、SOD的影響與Ctrl組相比較，模型組ROS含量極顯著升高（P＜0.001），MDA 含量顯著升高（P＜0.05），SOD 含量顯著降低（P＜0.001）。與模型組相比，ROS 和MDA 含量均隨PGG 濃度增加而逐漸降低（P＜0.001）；SOD 活力隨PGG 濃度增加而升高，其中5μM PGG 組較與模型組比較無明顯差異（P＞0.05），而10、20μM PGG 組SOD 活力顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。數據見表1。

表1 PGG對細胞中ROS、MDA、SOD表達水平的影響（χ±s，n=3）

4 討論

糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病的主要并發癥之一，是導致腎衰竭及終末期糖尿病發展的主要原因，嚴重威脅人類生命健康安全[8-9]。誘發糖尿病腎病的因素多種，高血糖誘導的細胞損傷及功能障礙是主要因素[8]，氧化應激是引發糖尿病腎病的根本原因。許多證據表明，在糖尿病發病機制中氧化應激起核心作用[13]。細胞在高糖和AGEs狀態下產生氧化應激反應，引起大量細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生，導致細胞損傷。研究表明，具有強抗氧化性的白藜蘆醇可以顯著抵抗糖尿病腎纖維化進展，從而抑制DN 的發展，其機制是激活Nrf2抗氧化信號通路，猝滅由AGEs誘導產生的ROS，進而達到保護細胞、減緩DN發展的作用[14]。

細胞內有氧化系統及抗氧化系統，氧化系統可產生大量活性氧自由基，導致細胞損傷。為了抵抗和清除細胞內過量的氧自由基，機體建立了一個獨立完整的防御系統，即抗氧化系統，抗氧化系統不僅可以保護細胞免受自由基帶來的傷害還能有效抑制脂質過氧化反應。抗氧化系統與氧化系統之間的不平衡可能導致脂質過氧化、蛋白質修飾和DNA損傷，進而引發細胞損傷及功能障礙[15]。Nrf2 是細胞內抗氧化系統中的調節因子，調控許多Ⅱ相代謝酶及抗氧化基因的表達以維持體內平衡[16]。基因敲除法已證明了其通用的細胞保護特征，正常情況下Nrf2 和Keap1 (kelch-like ECH-associated protein-1)結合以非活性狀態存在于胞漿中且轉錄活性較低，當細胞受到ROS 或其他有害刺激后，Nrf2 發生磷酸化，致使Nrf2與Keap1解偶聯，Nrf2以非活性狀態轉變為活性狀態，由胞漿進入胞核，與核內抗氧化原件(antioxidant response elements,ARE) 結合，啟動下游多種靶蛋白的表達。這些靶蛋白能在被激活后調節機體內氧化還原平衡，使機體從氧化應激狀態恢復到正常的生理狀態[6]。Xie 等[17]研究發現，鼠尾草酸(carnosic acid,CA)作用于AGEs誘導的系膜細胞氧化應激損傷模型，發現CA組胞漿中Nrf2下降，胞核中Nrf2增加，且HO-1 表達水平升高，炎癥因子下調。Kim 等[18]研究發現，葛根素通過激活Nrf2，進而促進HO-1 的表達，從而降低AGEs 刺激小鼠系膜細胞引起的炎癥損傷。

Nrf2 在AGEs 誘導的炎癥中起作用，它可上調細胞血紅素加氧酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的表達，從而保護細胞免受炎癥損傷[14]。HO-1是Nrf2調節的Ⅱ相解毒酶之一，由它引起的下級信號通路具有抗氧化應激的保護作用。上調的HO-1 可將血紅素降解成膽綠素、CO和Fe2+，CO作為NF-kB途徑的抑制劑，導致促炎癥細胞因子表達量降低，而膽紅素也作為抗氧化劑。此外，HO-1直接抑制促炎癥細胞因子以及激活抗炎細胞因子，使炎癥過程達到平衡[19]。SOD是受Nrf2調控的抗氧化蛋白酶，屬于一種金屬酶，是機體內氧自由基的頭號殺手。SOD 通過歧化反應將超氧自由基轉變為H2O2和H2O，H2O2在過氧化氫酶(catalase，CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GS-Px)作用下生成H2O，從而保護細胞免受氧化應激損傷[6]。研究證實，MDA是氧自由基ROS攻擊生物膜中不飽和脂肪酸引發脂質過氧化作用而形成的脂質過氧化物，其含量的升高會進一步引發氧自由基ROS 的產生[13]，因此MDA 的含量常常可反映機體內脂質過氧化的程度，間接反應細胞的損傷程度，SOD活力的升高將引起MDA含量的下降。激活Nrf2下游抗氧化蛋白如HO-1、SOD 的表達，可降低ROS、MDA 產生并減少氧化損傷，發揮抗氧化保護細胞的作用。Nrf2 抗氧化信號通路對DN 起著重要保護作用，增強Nrf2 抗氧化通路途徑可緩解DN 的發展[8,20]。Zheng[12]等研究發現，Nrf2的活化不僅可以改善STZ誘導的糖尿病模型中的代謝紊亂，還可以減少高葡萄糖介導的系膜細胞外基質積累及ROS 產生，從而達到治療DN的作用。

本實驗結果表明PGG 能增加細胞中Nrf2、HO-1的表達，促進Nrf2 向細胞核中轉移，降低氧化應激。提示PGG 通過激活Nrf2/HO-1 抗氧化信號通路保護系膜細胞損傷。