四氫黃連堿體外抗炎作用及機(jī)理研究

黃慧敏，王紅梅，張斌強(qiáng)，陳琴華

（湖北省湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北十堰 442008）

炎癥的過(guò)度反應(yīng)會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害。傳統(tǒng)的抗炎藥物主要是甾體抗炎藥和非甾體抗炎藥，臨床療效顯著，但是副作用頻見(jiàn)報(bào)道[1，2]。因此，尋找高效低毒的新型抗炎藥是目前藥物研究的重要方向。近年來(lái)，天然藥物的抗炎作用得到了越來(lái)越廣泛的認(rèn)可。四氫黃連堿（THC）是傳統(tǒng)中藥夏天無(wú)、延胡索、塞北紫堇的重要成分。目前，對(duì)THC的研究多集中于提取、分離及鑒定[3]，對(duì)其生物活性尤其是抗炎活性的研究較少。本課題組前期研究結(jié)果顯示，THC可顯著減輕角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足腫脹、二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹，提示其具有一定的體內(nèi)抗炎作用[4]。基于此，本研究采用硝酸還原酶法、酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法探討THC的體外抗炎機(jī)理，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雌性昆明種小鼠，20～25 g，由西安交通大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK（陜）2015-002。

1.2 主要藥物與試劑 THC，購(gòu)自寶雞市辰光生物工程有限公司，含量＞98%。胎牛血清（民海生物工程有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；巰基乙醇酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；脂多糖（LPS，美國(guó)Sigma公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國(guó)Sigma公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）ELISA試劑盒（美國(guó)Rapidbio公司）；一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；核蛋白提取試劑盒（美國(guó)Millipore公司）；核因子kappaB（NF-κB）p65試劑盒（上海Active Motif公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Pierce公司）。

1.3 主要儀器 ASS150A型超聲震蕩儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；XDS-1B型倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；Sigma 2-16PK高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；SP-2102UV型紫外可見(jiàn)分光光度儀（上海光譜儀器有限公司）；Bio-TekELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。

1.4 觀(guān)察指標(biāo)與方法

1.4.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 給予小鼠腹腔注射1.5～2.0 mL巰基乙醇酸鈉溶液，連續(xù)注射7 d后，脫臼處死；于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液中浸泡5 min，無(wú)菌條件下腹腔注射預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）5 mL，輕揉小鼠腹部約5 min，靜置5 min；注射器抽取腹腔液約4 mL，收集的腹腔液4℃以1 000 r/min離心5 min，倒去上清，PBS洗滌2次；富集的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用含有胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋后置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及CD68免疫組化染色對(duì)分離的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.4.2 MTT法檢測(cè)巨噬細(xì)胞活性 為考察THC對(duì)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響，取“1.4.1”項(xiàng)下細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，THC低、中、高劑量組，每組6個(gè)復(fù)孔。孵育24 h后，各組細(xì)胞分別加入THC母液，調(diào)整使THC終濃度分別為1、2、3 μmol/L，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組加入相應(yīng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h，每孔加入20 μL新配制的5 g/L的MTT，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加150 μL DMSO，振動(dòng)10 min后使甲瓚充分溶解。于560 nm處測(cè)吸光度[D（λ）]，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（p/%）=[THC組D（λ）值-空白對(duì)照組D（λ）值]/[模型對(duì)照組D（λ）值-空白對(duì)照組D（λ）值]×100%。

1.4.3 硝酸還原酶法檢測(cè)NO含量 取“1.4.1”項(xiàng)下細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL密度接種于24孔板，與不同濃度的THC共培養(yǎng)24 h。孵育結(jié)束后，THC低、中、高劑量組和模型對(duì)照組加入LPS（終濃度為10 μg/mL），空白對(duì)照組加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集上清液，具體步驟按照NO試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。于540 nm處測(cè)吸光值[D（λ）]，并計(jì)算NO的含量及抑制率。公式：NO含量[c/（μmol·L-1）]=[測(cè)定管平均D（λ）值-空白管平均D（λ）值]/[標(biāo)準(zhǔn)管平均D（λ）值-空白管平均D（λ）值]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣品稀釋倍數(shù)。NO抑制率（p/%）=[模型對(duì)照組NO平均含量-給藥組NO平均含量]/模型對(duì)照組NO平均含量×100%。

1.4.4 qPCR法檢測(cè)TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)與處理同“1.4.3”項(xiàng)，收集各組細(xì)胞，分別提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，應(yīng)用上述逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)。TNF-α上游引物序列：5’-TTCTGTCCCTTTCACTCACTGG-3’，下游引物序 列 ： 5’-TTGGTGGTTTGCTACGACGTGG-3’；IL-6上游引物序列：5’-GTACTCCAGAAGAC CAGAGG-3’，下游引物序列：5’-TGCTGGTGAC AACCACGGCC-3’；β-actin上游引物序列：5’-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3’，下游引物序列： 5’-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3’。PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)總體積25 μL，10×緩沖液2.5 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，上游引物 0.8 μL，下游引物0.8 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，模板1 μL，雙蒸水補(bǔ)足25 μL。預(yù)變性（94 ℃ 5 min），PCR擴(kuò)增（94℃30 s；60℃ 30 s；72℃30 s；35個(gè)循環(huán)）。延伸時(shí)讀取吸光度值，采用最大二階導(dǎo)數(shù)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算TNF-α、IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（p）。

1.4.5 ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL-6含量 細(xì)胞培養(yǎng)與處理同“1.4.3”，收集細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)于450 nm處測(cè)吸光值[D（λ）]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算TNF-α和IL-6的含量及抑制率。TNF-α抑制率（p/%）=（模型對(duì)照組TNF-α平均含量-給藥組TNF-α平均含量）/模型對(duì)照組TNF-α平均含量×100%。IL-6抑制率（p/%）=（模型對(duì)照組IL-6平均含量-給藥組IL-6平均含量）/模型對(duì)照組IL-6平均含量×100%。

1.4.6 THC對(duì)NF-κBp65活性的影響 細(xì)胞培養(yǎng)與處理同“1.4.3”項(xiàng)，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞核蛋白提取過(guò)程如下：參照核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，收集各組細(xì)胞于Eppendorf管中，4℃300 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，棄去上清，加入胞漿裂解液，混勻細(xì)胞，置于冰上15 min，4℃250 r/min離心15 min，棄去上清；再次加入胞漿裂解液，輕輕吹打混勻細(xì)胞，4℃8 000 r/min離心20 min，棄去上清，沉淀于搖床冰上低速搖晃60 min，4℃16 000 r/min離心5 min，上清即為細(xì)胞核蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定核蛋白濃度，-80℃儲(chǔ)存待用。NF-κBp65 DNA活性測(cè)定過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，首先向各檢測(cè)孔中加入試劑盒自帶試劑，再加入含有相同質(zhì)量的各樣本核蛋白提取物20 μL，室溫下?lián)u床孵育60 min，依次加入一抗NF-κBp65以及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育后加入顯色劑以及終止液，并在5 min后于450 nm處測(cè)量吸光度[D（λ）]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其所對(duì)應(yīng)的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)合樣本的吸光度值，計(jì)算相應(yīng)測(cè)試樣品的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 作圖及統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad prism 5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，多組間比較采用單因素方差（one-way ANOVO）分析及t檢驗(yàn)，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 小鼠腹腔提取的巨噬細(xì)胞經(jīng)原代培養(yǎng)后，于顯微鏡下觀(guān)察，其大小在20～50 μm之間，多數(shù)細(xì)胞呈梭型或星型，少部分為圓形；經(jīng)CD68免疫組織化學(xué)染色，細(xì)胞呈棕色，表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。

2.2 THC對(duì)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響 圖1結(jié)果顯示，THC低、中、高劑量組細(xì)胞活性與模型對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明1～3 μmol/L范圍內(nèi)的THC對(duì)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞活性無(wú)影響。

圖1 THC對(duì)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響Figure 1 Effects of THC on the activity of mouse primary macrophages isolated from the abdominal cavity

2.3 THC對(duì)巨噬細(xì)胞分泌NO的影響 表1結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組NO含量增加（P＜0.001）；與模型對(duì)照組比較，THC低、中、高劑量組NO含量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001），且隨著THC劑量的增加，NO的分泌逐漸減少。表明LPS能顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌NO，說(shuō)明模型制備成功，給予不同濃度的THC干預(yù)后，NO的分泌被顯著抑制，且呈劑量相關(guān)性。

表1 THC對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌NO的影響Table 1 Effects of THC on the secretion of NO from mouse macrophages (-x±s)

2.4 THC對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)的影響 圖2結(jié)果顯示：模型對(duì)照組TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組顯著升高（P＜0.001）；THC低、中、高劑量組TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.001），且隨著THC劑量的增加，TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)下降。表明巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)可被THC顯著抑制，且具有劑量相關(guān)性。

圖2 THC對(duì)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α與IL-6 mRNA表達(dá)的影響 (-x±s)Figure 2 Effects of THC on mRNA expression levels of TNF-α and IL-6 in mouse primary macrophages isolated from the abdominal cavity

2.5 THC對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α與IL-6的影響 表2結(jié)果顯示：模型對(duì)照組TNF-α與IL-6含量較空白對(duì)照組顯著增加（P＜0.001）；與模型對(duì)照組比較，THC低、中、高劑量組TNF-α與IL-6含量較模型對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。表明經(jīng)不同濃度的THC干預(yù)后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α與IL-6的能力可得到不同程度的抑制，且呈劑量相關(guān)性。

2.6 THC對(duì)NF-κBp65 DNA結(jié)合活性的影響 表3結(jié)果顯示：模型對(duì)照組NF-κBp65 DNA結(jié)合活性較空白對(duì)照組顯著上調(diào)（P＜0.001）；THC低、中、高劑量組NF-κBp65 DNA結(jié)合活性明顯低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.001），且隨著THC劑量的增加，NF-κBp65 DNA結(jié)合活性顯著性降低。表明經(jīng)不同濃度的THC干預(yù)后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NF-κBp65 DNA結(jié)合活性被抑制，且呈劑量相關(guān)性。

表2 THC對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6的影響Table 2 Effects of THC on secretion of TNF-α and IL-6 from mouse primary macrophages isolated from the abdominal cavity induced by LPS (-x±s)

表3 THC對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中NF-κBp65 DNA結(jié)合活性的影響Table 3 Effects of THC on the activity of NF-κBp65 binding to DNA in mouse macrophages induced by LPS (-x±s)

3 討論

藥物對(duì)促炎因子的抑制作用通常是由以下2種情況造成的：一是藥物的毒性影響了細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，使細(xì)胞數(shù)量及功能下降，從而使促炎因子的表達(dá)減少，但這種減少與藥效無(wú)關(guān)；二是藥物影響了信號(hào)通路從而抑制促炎因子的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用，此為藥物的真實(shí)藥效表現(xiàn)。故在藥物無(wú)毒劑量下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)是考察藥物藥效的基礎(chǔ)[5]。MTT法由Mosmann T[6]于1983年首先提出，后經(jīng)Tada H等[7]人多次改進(jìn)，該方法具有簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，是一種能與放射活性檢測(cè)法相媲美的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果顯示，THC在1～3 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性，此藥物濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)真實(shí)反映THC的抗炎作用提供了保障。

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁主要成分之一，可有效激活巨噬細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，從而使相關(guān)炎性基因和蛋白的表達(dá)發(fā)生改變，促使巨噬細(xì)胞合成并分泌多種炎性因子如TNF-α、NO、IL-6和MCP-1等[8，9]。本研究結(jié)果顯示，LPS可顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α和NO，表明其可成功構(gòu)建體外炎癥模型。

NO是一種新型的多功能氣體小分子神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)也是活性較高的自由基，在各種生化過(guò)程當(dāng)中起著關(guān)鍵的作用。研究表明，多種急慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展均與NO有關(guān)，其在炎癥反應(yīng)中有著雙重作用：在生理狀態(tài)下，NO維持著一定的濃度，能夠傳遞細(xì)胞外信號(hào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能；在病理狀態(tài)下，NO水平通常會(huì)發(fā)生變化，過(guò)量的NO能夠促進(jìn)炎癥的反應(yīng)，并對(duì)機(jī)體造成損傷，如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)NO的水平明顯升高[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS單獨(dú)處理可促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌NO，而THC預(yù)處理則可抑制NO的過(guò)度分泌。

TNF-α是炎癥發(fā)生時(shí)機(jī)體內(nèi)最先出現(xiàn)并具有核心作用的炎癥介質(zhì)，是一種具有多效生物學(xué)作用的細(xì)胞因子[11]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體受到LPS刺激時(shí)，肝臟、心臟、輸卵管以及子宮等多個(gè)臟器可迅速大量地合成TNF-α，進(jìn)而加強(qiáng)中性粒細(xì)胞的趨化作用，并與機(jī)體隨后合成的細(xì)胞因子IL-1、IL-6等協(xié)同作用，激發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12-14]。本研究結(jié)果顯示，THC預(yù)處理可顯著抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α。

IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，也是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要因素，通常能與其他炎性因子起到協(xié)同作用，放大炎癥反應(yīng)從而對(duì)機(jī)體造成損傷，因此IL-6水平可作為判斷炎癥反應(yīng)程度的指標(biāo)[15-17]。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激可促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-6，而THC預(yù)處理則可抑制IL-6的表達(dá)和分泌，此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了THC具有良好的體外抗炎作用。

NF-κB是最先在人類(lèi)B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種核蛋白因子，具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。NF-κB廣泛存在于機(jī)體各種類(lèi)型的細(xì)胞中，在細(xì)胞靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制物IκB非共價(jià)結(jié)合而存在于細(xì)胞質(zhì)中，此時(shí)的NF-κB不表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性；當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，IκB會(huì)發(fā)生磷酸化，從IκB與p65、NF-κBp50二聚體復(fù)合物上脫離并暴露出入核信號(hào)，從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核，結(jié)合特定的DNA基因序列，誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，通過(guò)不同的信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)趨化因子、細(xì)胞因子、粘附分子、生長(zhǎng)因子等的表達(dá)，從而影響機(jī)體的多種生物學(xué)功能[18-20]。為明確THC的抗炎作用是否與NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，本課題組首先對(duì)此通路中的關(guān)鍵分子NF-κBp65進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示LPS可以顯著誘導(dǎo)NF-κBp65與DNA的結(jié)合活性，而THC預(yù)處理能夠有效抑制活性的增加。

綜上所述，THC對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、NO、IL-6等炎癥因子及NF-κBp65活性有顯著的抑制作用，表明THC在細(xì)胞水平具有抗炎活性，且其體外抗炎作用可能與阻斷細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的激活從而下調(diào)促炎因子的表達(dá)和分泌有關(guān)。