UPLC-UV 法同時測定葛酮通絡(luò)膠囊中的6種活性成分

吳云山，廖俊城，張昌林，陳梅，倪小佳，蔡業(yè)峰，劉博，果德安

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣東廣州 510006；2.中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203）

葛酮通絡(luò)膠囊是安徽九方制藥和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所共同開發(fā)的二類新藥，于2006年上市銷售[1]。葛酮通絡(luò)膠囊具有活血化瘀的作用，臨床上主要用于治療缺血性中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)瘀血痹阻脈絡(luò)證，癥見半身不遂、口舌歪斜、偏身麻木、語言不利、頭暈?zāi)垦！㈩i項強(qiáng)痛等，還可以用于動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死[2]和腔隙性腦梗塞[3]等疾病。葛酮通絡(luò)膠囊由葛根的黃酮提取物制劑而成，其主要成分為葛根素。已有文獻(xiàn)報道，通過高效液相色譜（HPLC）方法[4，5]或者紫外分光光度法[6]建立其中主要成分葛根素的測定方法。除葛根素外，其提取物中還含有3’-羥基葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素等其他黃酮類化合物，而這些結(jié)構(gòu)相似的化合物也是活性物質(zhì)[7]。為更全面地控制葛酮通絡(luò)膠囊質(zhì)量，本研究利用超高液相色譜（UPLC）高效快速、分離度高的優(yōu)點，擬采用超高液相色譜—紫外（UPLC-UV）方法以達(dá)到準(zhǔn)確、快速、全面、系統(tǒng)地控制其質(zhì)量的目的。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC超高效液相[配有二元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、可調(diào)波長紫外（TUV）檢測器、Empower 2軟件]（美國Waters公司）；Waters BEH Shielded RP-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 試藥與樣品 葛酮通絡(luò)膠囊（批號：160101、161002、170707）由安徽九方藥業(yè)有限公司提供。葛根素（批號：110752-201615）、大豆苷（批號：111738-201603）、染料木苷（批號：111709-201702）、大豆苷元（批號：111502-200402）、染料木素（批號：111704-201703）購自中國生物制品及生物檢定院；3’-羥基葛根素（批號：PS000054，HPLC歸一化純度99.8%）購自成都普思生物科技有限公司。

1.3 試劑 乙腈（色譜級，德國默克股份兩合公司，4 L）；甲醇（色譜級，德國默克股份兩合公司，4 L）；甲酸（色譜級，天津富宇精細(xì)化工有限公司，500 mL）；水為超純水（德國默克密理博有限公司，ELIX超純水系統(tǒng)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 稱取各對照品適量，置5 mL容量瓶中加甲醇，超聲20 min，補(bǔ)足容量，搖勻，過濾；精密量取1 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋，制成每1 mL含3’-羥基葛根素20 μg、葛根素 50 μg、大豆苷 50 μg、染料木苷 10 μg、大豆苷元10 μg、染料木素10 μg的溶液。

2.2 樣品溶液制備 取膠囊內(nèi)容物適量，混合均勻，精密稱定粉末25 mg，置于25 mL容量瓶中，甲醇定容至25 mL，超聲處理20 min，取出，放冷，甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量；搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液0.1 mL，稀釋至1 mL，即得。

2.3 色譜條件 流動相：乙腈-0.1%甲酸溶液梯度洗脫。流速：0.2 mL·min-1；柱溫：35℃；檢測波長：250 nm；進(jìn)樣量5 μL。依照上述色譜條件，分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液和空白溶液5 μL，分別進(jìn)樣，記錄10 min色譜圖（圖1）。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）、樣品（B）及空白樣品（C）的色譜圖Figure 1 The chromatography of reference compounds（A），capsule sample（B） and blank sample（C）

由圖1可見，標(biāo)準(zhǔn)品在實驗條件下分離度良好（＞2），所有峰的塔板數(shù)都＞38 000，在樣品中呈現(xiàn)相應(yīng)的保留時間，空白樣品無干擾。

2.4 線性范圍、檢測限、定量限考察 精密吸取對照品溶液適量，倍比稀釋成不同濃度的對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣5 L，計算其峰面積。利用峰面積和濃度計算回歸曲線及相關(guān)系數(shù)，通過稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，當(dāng)樣品的信噪比（S/N）分別為3和10時獲得檢測限（LODs）和定量限（LOQs）。信噪比通過峰高與背景噪音的比值獲得。結(jié)果見表1。

2.5 精密度實驗 取同一個供試品，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算各成分的峰面積及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（sR），結(jié)果顯示sR小于2%，表明儀器的精密度良好。結(jié)果見表2。

表1 6種成分的線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear equation and correlation coefficients for the 6 constituents

表2 精密度實驗結(jié)果Table 2 The results for precision test

2.6 重復(fù)性考察 精密稱取供試品（批號：170707）100 mg，定容至5 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液1 mL，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測各個峰面積積分值。其sR分別為：3’-羥基葛根素，1.23%；葛根素，1.33%；大豆苷，1.31%；染料木苷，1.52%；大豆苷元，1.24%；染料木素，1.48%。表明該法重復(fù)性良好。結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性考察結(jié)果Table 3 The repeatability survey results

2.7 穩(wěn)定性實驗 取供試品（批號：170707）溶液，分別在0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定各色譜峰峰面積，統(tǒng)計各峰的sR。結(jié)果顯示所選的6個成分3’-羥基葛根素、葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的sR分別為1.25%、1.78%、1.51%、1.17%、0.58%、0.96%，表明樣品穩(wěn)定性良好。結(jié)果見表4。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品（批號：170707），分別加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，按照“2.3”項的方法進(jìn)行測定，每個樣品用同樣的方法重復(fù)測定6次，計算其含量和sR，結(jié)果顯示加樣回收率符合標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果見表5。

2.9 樣品含量測定 3個批號（160101、161002、170707）的樣品分別按照“2.2”項制得供試品溶液，按照“2.3”項下色譜條件測試，測得樣品中各成分含量見表6。可見3個批號樣品中所檢測成分的含量相對穩(wěn)定。結(jié)果見表6。

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 4 The results for stability test

表5 加樣回收率實驗結(jié)果Table 5 The average recovery results

表6 葛酮通絡(luò)膠囊中各成分含量Table 6 Comparison of the contents of various constituents in Getong Tongluo Capsules （m/mg）

3 討論

葛根通絡(luò)膠囊由葛根總黃酮提取物制成，所含黃酮結(jié)構(gòu)相似，在體內(nèi)還可能經(jīng)代謝而互相轉(zhuǎn)化，因此各種黃酮成分可能對它的藥理活性產(chǎn)生疊加效應(yīng)[8]。目前，葛酮通絡(luò)膠囊的質(zhì)量靠其主成分葛根素和樣品的指紋圖譜來控制。本實驗同時測定了葛酮通絡(luò)膠囊的6個主要黃酮類成分的含量，有助于其質(zhì)量的全面控制。本實驗建立的UPLC方法與之前的HPLC方法相比較，大大縮短了檢測時間，具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點，是對其質(zhì)量控制方法的有益補(bǔ)充。