TUBB6在胃癌中的表達情況及臨床意義

張敏，左云，盧瑋冬

張家港市第一人民醫院（蘇州大學附屬張家港醫院）腫瘤科，江蘇 張家港 215600

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一，發病率居全部惡性腫瘤第4位，病死率居全部惡性腫瘤第2位[1]。隨著分子生物學的快速發展，與胃癌相關的腫瘤標志物的研究日益得到關注。β微管蛋白Ⅴ（tubulin beta 6 classⅤ，TUBB6）是β微管蛋白的亞型之一，由TUBB6基因編碼。TUBB6廣泛表達于人類的各種正常組織中，其在乳腺組織和肺組織中的表達量分別占β微管蛋白表達量的11%和10%[2]。TUBB6也廣泛表達于腫瘤細胞，其在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結直腸癌細胞中均異常高表達[3-7]。但目前關于TUBB6在胃癌中表達情況的報道較少，本研究通過免疫熒光染色和免疫組織化學染色方法，探討TUBB6在胃癌細胞中的定位及在胃癌組織中的表達情況，并分析其表達情況與胃癌患者臨床特征的關系，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2017年1—12月于張家港市第一人民醫院接受手術治療的90例胃癌患者。納入標準：年齡為18～85歲；經病理檢查確診為胃癌；預計生存期≥3個月。90例患者中，男61例，女29例；年齡為31～83歲，中位年齡為65.5歲；病理類型：腺癌66例（乳頭狀腺癌3例，黏液腺癌5例，管狀腺癌58例），印戒細胞癌13例，未分化癌11例；分化程度：中/高分化16例，低分化60例，未分化14例；有淋巴結轉移64例，無淋巴結轉移26例；有遠處轉移3例（1例卵巢轉移，1例結腸轉移，1例肝實質轉移），無遠處轉移87例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期54例。所有患者術前均未行放療或化療等抗腫瘤治療。收集患者的胃癌組織90例及癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）45例進行研究，術中取得標本后立即轉移至-80℃冰箱中保存備用。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 細胞及主要試劑

細胞：正常胃黏膜上皮細胞株GES-1和胃癌細胞株BGC-823（低分化）均購自上海吉凱基因科技有限公司。主要試劑：TUBB6抗體、Alexa Fluor 555標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（H+L）高交叉吸附的二抗均購自美國Proteintech公司，兔抗人TUBB6多克隆抗體購自艾博抗（上海）貿易有限公司，鼠抗兔UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 免疫熒光染色

將正常胃黏膜上皮細胞株GES-1和胃癌細胞株BGC-823培養后，制成（1～2）×104/ml的單細胞懸液，接種于96孔板中，置于CO2培養箱中培養3天。待細胞長成單層后，采用4%多聚甲醛將細胞固定；0.2%Triton破膜穿孔；滴加封閉液于濕盒中，室溫封閉；采用抗體稀釋液稀釋一抗（TUBB6抗體，1∶200稀釋），滴加一抗，置于濕盒內，37℃孵育；采用抗體稀釋液稀釋二抗（Alexa Fluor 555標記的山羊抗鼠二抗，1∶300稀釋），滴加二抗，置于濕盒內，37℃保溫、避光；熒光顯微鏡鏡檢、拍照。

1.4 免疫組織化學染色

90例胃癌組織和45例癌旁組織標本均經10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片。將組織切片進行脫蠟和水化；采用3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，抗原熱修復；滴加10%血清封閉非特異性結合位點，依次滴加一抗（兔抗人TUBB6多克隆抗體，1∶500稀釋）和二抗（鼠抗兔S-P超敏試劑盒）；加入二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染；最后脫水、封片、鏡檢。

1.5 免疫組織化學染色結果判定

TUBB6定位于細胞質，陽性染色細胞中可見棕色顆粒。由2位病理科醫師進行判斷，在高倍鏡（×400）下觀察5個視野，每個視野計數200個細胞。根據染色強度進行評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據陽性細胞所占百分比進行評分：＜1%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。染色強度評分與陽性細胞所占百分比評分相乘，0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。其中，≥1分即為陽性。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計學分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TUBB6在不同細胞株中的免疫熒光染色結果

TUBB6在正常胃黏膜上皮細胞株GES-1、胃癌細胞株BGC-823中均可檢測到免疫熒光信號，且胃癌細胞株BGC-823中的熒光染色強于正常胃黏膜上皮細胞株 GES-1（圖 1A、2A）；經 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）核復染（圖1B、2B），進一步提示TUBB6定位在細胞質。

圖1 正常胃黏膜上皮細胞株GES-1中TUBB6的表達情況（免疫熒光染色，×400）

圖2 胃癌細胞株BGC-823中TUBB6的表達情況（免疫熒光染色，×400）

2.2 胃癌組織和癌旁組織中TUBB6表達情況的比較

TUBB6在胃癌組織中主要表達于細胞質，呈不同程度的表達；TUBB6在癌旁組織中也表達于細胞質，但染色較淺（圖3、圖4）。分析45例胃癌組織及其對應癌旁組織中TUBB6的表達情況，結果顯示，胃癌組織中TUBB6的陽性表達率為88.9%（40/45），低于癌旁組織的68.9%（31/45），差異有統計學意義（χ2=5.404，P＜0.05）。

圖3 胃癌組織及癌旁組織中TUBB6的表達情況（免疫組織化學染色，×400）

圖4 胃癌組織中TUBB6的染色情況（免疫組織化學染色，×400）

2.3 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中TUBB6的表達情況

90例胃癌組織中，TUBB6的陽性表達率為88.9%（80/90）。不同性別、年齡的胃癌患者胃癌組織中TUBB6的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同病理類型、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期及Lauren分型的胃癌患者胃癌組織中TUBB6的陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

3 討論

胃癌是臨床中常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響人類的生命健康，其發病機制尚未完全闡明。研究發現，胃癌由多種基因調控失衡發展而來，與原癌基因C-erbB-2、c-myc、ras的激活和抑癌基因p21、p53的失活有關，上述基因表達的變化對胃癌的生物學行為及預后均產生影響[8-10]。目前在胃癌中尚缺乏特異性或敏感性高的生物標志物，由于部分生物標志物受技術和成本的限制，尚未進入臨床應用階段，因此尋找一些新的具有臨床應用價值的生物標志物對胃癌的研究具有重要意義。

表1 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中TUBB6表達情況的比較（n=90）

微管是細胞骨架的重要組成部分，普遍存在于真核細胞中，參與細胞形態的維持、細胞內物質運輸、細胞運動、細胞分裂及分化等過程。微管由微管蛋白和微管輔助蛋白組成[11]。微管蛋白是一種異質二聚體蛋白，由α微管蛋白和β微管蛋白組成，至少有6個α微管蛋白和7個β微管蛋白亞型，兩者在細胞質內保持高度動態平衡[12]。微管蛋白是有絲分裂時紡錘體的組成部分，也是抗微管藥物的主要作用靶點。通過一種新的實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術，可以精確地測量出人類β微管蛋白亞型Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅴ和ⅥmRNA的表達水平，它們分別由TUBB、TUBB2A、TUBB2B、TUBB3、TUBB4、TUBB2C、TUBB6和TUBB1基因編碼[2]。

Verdier-Pinard等[13]首次在人類細胞系中檢測到TUBB6，并發現在上皮樣卵巢癌細胞系Hey中高表達。研究發現，TUBB6在具有分泌功能的輸卵管上皮細胞中具有組織特異性；TUBB6在漿液性卵巢癌中高表達，尤其是在分化較差、乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）突變的漿液性卵巢癌中，TUBB6的表達水平更高[6]。漿液性卵巢癌中TUBB6高表達可能與漿液性卵巢癌的發展有關，具有遷移能力的輸卵管上皮細胞脫落，然后附著于鄰近的卵巢上皮細胞，是卵巢癌起始和惡性播散的來源[14-15]。TUBB6的異常表達提示輸卵管上皮分泌細胞的異型性是癌前病變的表現。研究表明，在浸潤性乳腺癌中TUBB6呈高表達，尤其是低分化浸潤性乳腺癌，提示TUBB6的高表達與乳腺癌的分化程度及惡性轉移有關[4]。另有研究表明，TUBB6在非小細胞肺癌中高表達，提示TUBB6可作為非小細胞肺癌的生物標志物[5]。在女性結直腸癌及轉移性結直腸癌中TUBB6呈高表達，且表現出較差的預后，提示TUBB6可作結直腸癌侵襲性及預后的預測因子[7]。在非腫瘤疾病中，TUBB6突變與常染色體顯性非進行性先天性面癱、雙側上瞼下垂和腭咽功能障礙有關[16]。

TUBB6作為微管蛋白亞型之一，其表達水平同樣也影響細胞分裂和抗微管藥物的敏感性。研究表明，TUBB6的過表達會破壞細胞骨架結構，抑制微管組裝，改變微管的動態不穩定性，并促使微管從中心體蛋白分離，進而引起細胞分裂，并對紫杉醇耐藥[17-19]。而微管穩定藥物紫杉醇可增加具有組裝能力的微管蛋白補丁，抑制微管分離，穩定微管，進而抑制細胞分裂，消除TUBB6過表達的表型效應。此外，TUBB6過表達或缺失均會抑制有絲分裂，影響微管的穩定性或動態行為，從而抑制細胞增殖。另有研究發現，盡管TUBB6的過表達存在毒性作用（如破壞細胞骨架結構、抑制微管組裝和藥物耐藥等），但在某些細胞中，少量的TUBB6表達對維持微管的可塑性和細胞分裂是必需的[20]。由于TUBB6表達的獨特性以及一些惡性腫瘤的特征性表現（如分化差、轉移性等），提示TUBB6表達情況的改變可能與腫瘤的發生有關[4]。因此可推測，TUBB6過表達在惡性腫瘤中可能引起惡性生物學行為，如分裂增殖、轉移、浸潤、侵襲等，微管穩定藥物如紫杉醇則可抑制TUBB6過表達引起的惡性生物學行為，達到治療的目的。

本研究中，TUBB6定位于胃癌細胞的細胞質，與之前的研究結果一致[4]。既往研究證實，TUBB6在非小細胞肺癌和正常肺組織中的表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）[5]。本研究結果表明，胃癌組織及其對應的癌旁組織中TUBB6的陽性表達率分別為88.9%（40/45）和68.9%（31/45），差異有統計學意義（P＜0.05）。既往研究表明，在分化差的漿液性卵巢癌、低分化浸潤性乳腺癌、非小細胞肺癌、女性結直腸癌及轉移性結直腸癌中，TUBB6均呈高表達，提示TUBB6高表達與腫瘤的預后、分化程度、侵襲性、惡性轉移有關[4-7]。本研究結果顯示，不同病理類型、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期及Lauren分型的胃癌患者胃癌組織中TUBB6的陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。由此可推測TUBB6可能與胃癌的發生發展具有密切關系，可作為胃癌的生物標志物，并可能預測患者預后。

綜上所述，TUBB6在胃癌組織中的表達水平較高，且其表達情況與患者的臨床特征有關，可能與胃癌的發生發展具有密切關系，可作為胃癌的生物標志物。