叉頭框D3蛋白在胃癌組織中的表達及臨床意義

唐思鋒，張升波，王鋒，李濤

濟南市人民醫院胃腸外科，濟南 271100

研究表明，70%的胃癌發生于發展中國家，其中男性與女性胃癌的發病比例為2∶1[1]。在中國，胃癌的發病率居所有腫瘤的第2位，病死率居所有腫瘤的第3位，嚴重威脅著人們的生命安全[2]。經手術、放化療等抗腫瘤治療后，早期胃癌患者的5年生存率明顯提高；但是，由于多數胃癌患者確診時已處于中晚期，錯失了最佳的治療時期，因而預后較差[3]。因此，尋求一種有效的早期胃癌診斷方案成為目前臨床研究的熱點。叉頭框D3蛋白（forkhead box D3，FOXD3）是叉頭框蛋白家族成員之一，屬于干細胞多功能因子，可以參與調控胚胎發育、糖類代謝、脂質代謝、免疫調節、細胞周期調控及生物老化等多個過程；同時，其還與上皮性卵巢癌等多種腫瘤的發生、發展密切相關[4]。本研究對胃癌患者胃癌組織中FOXD3的表達水平及與患者臨床特征的關系進行研究，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年6月至2018年6月濟南市人民醫院收治的118例胃癌患者。納入標準：①符合《中國臨床腫瘤學會（CSCO）原發性胃癌診療指南》[5]中相關標準；②經超聲胃鏡及手術后病理學檢查確診為胃腺癌；③獲取胃癌組織標本前，無放化療史及幽門螺桿菌治療史；④病歷資料完整。排除標準：①患有免疫系統疾病者；②患有類風濕性疾病者；③復發或轉移性胃癌。118例胃癌患者中，男67例，女51例；年齡42～77歲，平均（56.8±10.2歲）；TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期49例，Ⅲ期37例，Ⅳ期10例；病灶直徑：≥3.0 cm 75例，＜3.0 cm 43例；有淋巴結轉移58例，無淋巴結轉移60例；組織學分化程度：高分化32例，中分化43例，低分化43例。收集胃癌患者的胃癌組織標本及對應的癌旁組織標本各118例。本研究經醫院倫理委員會審核通過。

1.2 免疫組化染色法檢測FOXD3蛋白表達

取胃癌組織和癌旁組織標本進行切片，脫蠟、水化處理后，于高溫高壓環境下選用枸櫞酸鹽修復液進行抗原修復操作，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次；采用3 ml 3%H2O2清除過氧化酶活性，反應10 min，PBS洗滌2次；50 μl 3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉液孵化15 min，加入鼠抗人FOXD3單克隆抗體（濃度1∶2000），室溫下過夜，PBS洗滌2次；加入羊抗兔二抗，孵育30 min，PBS洗滌2次；隨后選用二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑進行3 min顯色操作，并選用蘇木素復染30 s，乙醇脫水，透明封片，鏡檢。

1.3 免疫組化染色法評定標準

免疫組化染色法評定標準：FOXD3蛋白染色見于細胞核內，該蛋白陽性染色呈黃色、棕黃色、褐色。根據染色程度進行評分：0分，未著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，褐色或黑色。根據陽性細胞所占比例進行評分：陽性細胞所占比例≤10%計1分，陽性細胞所占比例為11%～50%計2分，陽性細胞所占比例為51%～75%計3分，陽性細胞所占比例＞75%計4分。將染色程度評分與陽性細胞所占比例評分相乘，乘積＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測FOXD3蛋白表達

取胃癌組織和癌旁組織標本各5 g，剪碎，選用PBS洗滌2次，并置于勻漿器內，滴入5 ml蛋白裂解液，開啟振蕩模式，時間設置為15 min，取出樣本置于95℃溫箱內進行滅活，3500 r/min離心12 min，取上清，電泳后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，加入FOXD3一抗，-7℃冷藏過夜，洗膜緩沖液洗滌2次，加入山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗，孵育60 min，TBST再次洗膜，發光并通過美國賽默飛E-Gel Imager凝膠成像系統讀取結果。

1.5 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件對數據進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用配對t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FOXD3蛋白陽性表達率的比較

胃癌組織中FOXD3蛋白的陽性表達率為30.5%（36/118），明顯低于癌旁組織的69.5%（82/118），差異有統計學意義（χ2=35.262，P＜0.01）；免疫組化染色結果顯示，胃癌組織中可見少量棕黃色顆粒，癌旁組織中棕黃色顆粒較多（圖1）。

圖1 胃癌組織和癌旁組織中FOXD3蛋白的表達情況（免疫組化染色，×200）

2.2 FOXD3蛋白表達水平的比較

胃癌組織中FOXD3蛋白相對表達量為（0.68±0.13），明顯低于癌旁組織的（1.26±0.18），差異有統計學意義（t=28.644，P＜0.01）。（圖2）

注：1～4.癌旁組織；5～8.胃癌組織

2.3 胃癌組織中FOXD3蛋白陽性表達與胃癌患者臨床特征的關系

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度為T3～4、有淋巴結轉移、組織學分化程度為低分化胃癌患者胃癌組織中FOXD3蛋白的陽性表達率分別低于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、浸潤深度為T1～2、無淋巴結轉移、組織學分化程度為高-中分化的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。但不同病灶直徑胃癌患者胃癌組織中FOXD3蛋白的陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中FOXD3蛋白陽性表達情況的比較（n=118）

3 討論

FOXD3早期被稱為“Genesis”，有關Forkhead/Winged helix的國際會議根據DNA結合域的氨基酸序列分布特征，對叉頭框蛋白家族進行系統命名，FOXD3才開始被臨床所認可[6]。FOXD3具有維持胚胎發育的功能，研究表明，FOXD3可于胚胎干細胞及其惡性等價物胚胎瘤細胞中表達[7]。一項基于裸鼠模型的FOXD3移植實驗發現，FOXD3具有成瘤性，其可以促進細胞增殖及惡性轉化，表明FOXD3可能成為一種新型腫瘤干細胞表面標志物[8]。本研究結果顯示，胃癌組織中FOXD3蛋白的陽性表達率和相對表達量均明顯低于癌旁組織（P＜0.01）。相關研究結果顯示，沉默FOXD3可以提高成纖維細胞的增殖速度，且S期細胞所占比例增高，表明下調FOXD3表達可能增強了成纖維細胞的DNA合成活性，促進細胞增殖；隨后，該研究將FOXD3沉默后穩定細胞株注入小鼠體內，結果發現，所有小鼠均出現成瘤現象，并且瘤體增長速度較快，腫瘤干細胞核分裂相活躍，倍增時間為1.1天[9]；提示FOXD3可能與腫瘤的發生、發展密切相關。

FOXD3可以與DNA上的多種受體相結合，并且還可以在細胞分化時表達，因此FOXD3最初被當做轉錄抑制因子[10-11]。FOXD3可以抑制胚胎干細胞中與分化作用有關的基因表達，維持胚胎干細胞的功能；由于腫瘤干細胞與胚胎干細胞具有極高的生物學相似度，因而，FOXD3也可能通過抑制干細胞中與分化作用有關的基因來阻滯細胞的分化成熟，使細胞周期停止于某一個階段，即惡性化[12-13]。相關研究表明，敲除FOXD3基因的胚胎細胞無法用于體外建立胚胎干細胞系統，并且敲除FOXD3基因的上胚層細胞惡性誘導能力明顯下降[14]，表明FOXD3是胚胎期胚胎干細胞活化及功能維持的重要因子。本研究結果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度為T3～4、有淋巴結轉移、組織學分化程度為低分化胃癌患者胃癌組織中FOXD3蛋白的陽性表達率分別低于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、浸潤深度為T1～2、無淋巴結轉移、組織學分化程度為高-中分化的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示FOXD3或許可以用于評估胃癌患者的TNM分期、分化程度及淋巴結轉移情況。陳勇等[15]研究顯示，胃癌患者的分化程度越高，FOXD3的表達水平越低，提示FOXD3可能與胃癌的分化程度有關，與本研究結果一致。但由于本研究納入的樣本量較少，且樣本來源地域狹窄，因而尚存在一定不足。

綜上所述，胃癌組織中FOXD3表達水平明顯降低，且與胃癌的發生、發展密切相關，值得臨床進一步研究。