鎘脅迫對高低積累型水稻幼苗非蛋白巰基含量的影響

李冬琴，王麗麗，李智鳴，黎華壽，陳桂葵*

（1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江524048；2.華南農業大學農業農村部華南熱帶農業環境重點實驗室，廣州510642；3.廣州草木蕃環境科技有限公司，廣州510640）

鎘（Cadmium，Cd）是生物非必需元素，其毒害效應已受到人們的廣泛關注[1-2]。Cd進入土壤環境中容易被植物吸收，可通過食物鏈進入人體，不僅造成貧血、高血壓、骨痛病等疾病，而且還具有潛在的致癌作用，嚴重威脅食品安全、人體健康及農業的可持續發展[3-4]，是被公認的對人類最具威脅的主要有毒金屬之一。由于Cd的移動性強、毒性高、污染面積大而被稱為“五毒之首”[5]。長期以來，植物對重金屬污染的抗性（耐性）問題一直是污染生態學等研究領域的熱點問題。

水稻（Oryza sativaL.）是我國，尤其是南方地區主要的糧食作物，且品種繁多[6]。據研究，水稻品種不同對Cd 的吸收積累存在很大差異[7]。Cd 脅迫誘導植株體內產生活性氧（Reactive oxygen species，ROS），使細胞受到傷害，導致代謝紊亂，因此破壞植物正常的生理生化功能。為了抵御Cd 的毒害作用，植物進化了一系列抗性機制，如抗氧化酶和抗氧化劑清除活性氧的毒害；抗壞血酸-谷胱甘肽循環（AsA-GSH）系統維持細胞氧化還原平衡：液泡的區室化和外排機制；植物體內螯合物與Cd結合解除Cd的毒害[8-10]。

非蛋白巰基（Non-protein thiols，NPT）化合物主要包括還原型谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）、植物螯合肽（Phytochelatins，PCs）和半胱氨酸（Cysteine，Cys）等，是植物體內的一類多肽。植物體內的GSH、PCs、Cys 以及金屬硫蛋白（Metallothionein，MTs）等巰基物質可與細胞內游離的Cd離子配位結合轉化成絡合態存在于細胞質或運輸到液泡中[11]，從而減輕細胞質受到的Cd 毒害。PCs 在對Cd 的解毒、防御Cd引起的氧化脅迫和代謝方面具有重要作用。早在1990 年Verkleij 等[12]的報道中就表明，根系所吸收的Cd 至少有60%是以PC-Cd 復合物形式存在[12]。在水稻（Oryza sativa）、谷子（Setaria italicaL.）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、小麥（Triticum aestivum）、蓖麻（Ricinus communis）、大豆（Glycine max）等植物中證實了巰基物質在Cd 的螯合、固定等方面起著重要作用[13-18]。PCs是在植物螯合肽合成酶的作用下以GSH為底物合成的多肽。GSH是低分子量的抗氧化劑，對植物新陳代謝的維持起到很重要的作用[19]。GSH 具有清除自由基、抵抗過氧化損傷、保護酶和結構蛋白及膜系統的功能[11]。此外，與GSH代謝密切相關的解毒酶——谷胱甘肽硫轉移酶（Glutathione S-transferase，GST）在Cd 解毒過程中也發揮了重要作用[20]。GSH 在GST 的作用下可與細胞內的Cd離子絡合形成復合物，將有毒物質轉移到液泡內[21-22]，以達到緩解Cd 毒害的作用。范業賡等[23]發現，甘蔗葉片在Cd 脅迫下GSH 和NPT 含量有上升的趨勢，產生的GSH 和NPT可以有效地清除活性氧及自由基，阻止膜脂過氧化。高可輝[24]的研究表明，水稻幼苗體內的GSH含量隨處理時間的延長而逐漸增加，同樣說明GSH 對水稻解除Cd 的毒害發揮重要作用。然而，水稻品種不同在Cd 脅迫下的解毒過程不同，巰基物質含量對水稻Cd 污染較敏感[25]。Cd 脅迫對Cd 高低積累型水稻非蛋白巰基含量的影響機制研究不足，不利于指導解決水稻種植過程中遭受Cd脅迫的問題。

本實驗基于前期研究篩選出的高低Cd積累型水稻品種[26]，通過營養液沙培的方式，研究高低Cd 積累型水稻品種Cd 含量與非蛋白巰基化合物之間的關系，以及在Cd 脅迫下NPT（包括GSH 和PCs）和GST活性的動態變化規律，為揭示不同積累型水稻Cd 解毒的生理機制提供理論依據，也可為耐Cd 脅迫且低Cd 積累的水稻品種的選用和選育提供有效的生物學途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

本實驗選取的材料為前期實驗篩選出的Cd高積累型水稻品種欣榮優2045 和低積累型水稻品種優I2009[26]。采用營養液沙培方法，探討Cd 脅迫下不同耐性水稻中NPT、GSH、PC、GST、過氧化氫（H2O2）和硫代巴比妥酸反應產物（TBARS）的動態變化。培養基質為經干熱滅菌的河沙（150 ℃滅菌2 h，滅菌后50 ℃烘干備用）。將滅菌后的河沙裝入雙層嵌套使用的塑料杯（透明塑料杯的體積為700 mL，規格為9 cm×6.5 cm×10.5 cm），其中里面的塑料杯底部穿孔以方便更換營養液，外層塑料杯四周和底部用黑色遮光袋包住，以免光照對根系生長造成影響。

挑選飽滿的水稻種子用10%的H2O2消毒10 min，用無菌水清洗干凈，以除去H2O2，再用蒸餾水浸泡48 h，期間每日換水4 次。待種子露白后在溫度為25 ℃，相對濕度為75%的人工氣候箱暗箱中催芽24 h，挑選發芽一致的水稻種子均勻播種于裝好河沙的塑料杯中（1 kg·杯-1）。營養液參照國際水稻研究所（IRRI）推薦的水稻常規營養液配方配制（表1）。將水稻放置于人工氣候箱中進行培養，條件為：光照時間為14 h·d-1，光照強度為3000 lx，晝/夜溫度為28 ℃/25 ℃，晝/夜相對濕度為80%/75%。每2 d更換一次營養液。待幼苗長至四葉一心時，進行CdCl2處理。根據文獻研究設定Cd2+處理濃度為50 μmol·L-1。樣品分別在處理前（0，對照）和第1、3、5、7 d收獲。每個處理重復3次，每杯種植水稻2株。

1.2 測定方法

1.2.1 植物樣品的前處理

水培實驗結束后，小心采集水稻幼苗樣品，用自來水洗凈根系河沙及地上部雜物后用去離子水徹底清洗，然后將幼苗從基部剪開，分為根部和地上部。樣品一部分用于Cd含量的測定，另一部分存于-80 ℃超低溫冰箱冷藏供各項生理生化指標測定。

表1 水稻常規營養液配方（mg·L-1）Table 1 Conventional nutrient solution formula for rice（mg·L-1）

1.2.2 植物樣品中Cd含量的測定

稱取0.1 g 鮮樣，用硝酸和高氯酸的混酸（4∶1）消解后，用石墨爐原子吸收（ZEEnit700P，德國耶拿）測定樣品中Cd含量。

1.2.3 GSH和GST活性的測定

GSH 和GST 活性采用南京建成試劑盒推薦方法測定。蛋白含量測定用考馬斯亮藍染色法[27]，以結晶牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白。組織中GST活性（U·mg-1prot）：規定每毫克組織蛋白在37 ℃反應1 min，扣除非酶促反應，使反應體系中GSH 濃度降低1 μmol·L-1為一個酶活力單位。

1.2.4 NPT 和PCs 含量的測定

稱取1.00 g 水稻鮮樣，加4 mL 5%磺基水楊酸（SSA）冰浴研磨，12 000g離心15 min（4 ℃），上清液定容至10 mL。分袋保存。

NPT 物質含量測定采用Rama Devi 等[28]的方法：反應體系為1 mL 上清液與1.85 mL 0.2 mol·L-1的Tris-HCl（pH 8.2）和0.15 mL 10 mol·L-1的5，5-雙二硫（2-硝基苯甲酸）（DTNB），反應20 min 后用多功能酶標儀于412 nm 處測定吸光值，以不加DTNB 為空白。以GSH為-SH標樣，做標準曲線。

PCs含量用差減法計算[29]，即：PCs=NPT-GSH

1.2.5 H2O2和TBARS含量的測定

稱取1.00 g 鮮樣，加4.8 mL 5%三氯乙酸（TCA）冰浴研磨，12 000g離心15 min（4 ℃），上清液定容至10 mL。分裝保存。

H2O2的測定參照Jana 等[30]的方法：取1 mL 上清液，加0.3 mL 0.1%（m/V）硫酸鈦[溶于20%（V/V）硫酸]，410 nm下讀數（25 ℃）。

TBARS 含量參照Heath 等[31]的測定方法：取2 mL上清液，加2 mL 0.5%（m/V）TCA 于試管，搖勻后保鮮膜封口，95 ℃水浴30 min，冰浴終止。由532 nm 和600 nm下吸收度的差值計算TBARS含量。

1.2.6 數據分析

實驗數據以平均數±標準誤（Mean±Stand error）表示，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0進行數據計算和統計分析，并用Duncan′s 檢驗法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 Cd脅迫下高低積累型水稻品種間Cd吸收積累量的差異

隨Cd 脅迫時間的延長，兩品種水稻對Cd 的吸收積累均呈顯著上升趨勢（圖1）。在處理的第7 d 時，欣榮優2045 和優I2009 地上部對Cd 的吸收量均達到最大值，分別為59.80 mg·kg-1FW 和20.74 mg·kg-1FW，與第1 d 相比，增加了1.92 倍和3.10 倍；欣榮優2045 和優I2009 的根系對Cd 的吸收量也在第7 d 時達到最大值，分別為252.84 mg·kg-1FW 和126.54 mg·kg-1FW，與第1 d 相比，增加了2.26 倍和1.84 倍。而且各個處理時間段，無論是地上部還是根系，欣榮優2045對Cd的吸收積累均顯著高于優I2009。

2.2 Cd脅迫下高低積累型水稻品種間H2O2含量的差異

如圖2所示，兩品種水稻的H2O2含量隨處理時間的延長呈逐漸上升趨勢，第7 d 時，欣榮優2045 和優I2009 地上部的H2O2含量達最高值，分別為6.57 μmol·g-1和9.19 μmol·g-1，相較于對照，分別上升了45%和78%；欣榮優2045 和優I2009 根系H2O2的含量在第7 d 時也均達到最高值，分別為4.89 μmol·g-1和6.28 μmol·g-1，相較于對照，分別上升了1.14倍和1.32倍。綜上所述，優I2009 體內H2O2含量上升的幅度大于欣榮優2045，說明隨處理時間的延長，優I2009 受Cd的毒害作用更大。

圖1 水稻幼苗積累Cd的動態變化Figure 1 Dynamic changes of Cd accumulation in rice seedling

圖2 Cd脅迫對H2O2含量的影響Figure 2 Effect of cadmium stress on H2O2content

2.3 Cd 脅迫下高低積累型水稻品種間TBARS 含量的差異

隨時間延長，兩品種水稻地上部和根系的TBARS 含量的變化趨勢與H2O2相似（圖3）。欣榮優2045 地上部的TBARS 含量在第1、3、5、7 d 比對照分別增加了7%、29%、59%和74%，優I2009 地上部的TBARS 含量分別上升了12%、56%、72%和120%；欣榮優2045 根系TBARS 的含量在第1、3、5、7 d 比對照分別上升了6%、19%、28%和61%，優I2009 根系的TBARS 含量分別上升了22%、32%、53%和64%。綜上所述，優I2009體內TBARS 含量上升的幅度大于欣榮優2045，同樣說明優I2009 水稻品種對Cd 的耐受性相較于欣榮優2045更弱。

2.4 Cd脅迫下高低積累型水稻品種間NPT含量的差異

如圖4 所示，隨Cd 處理時間的延長，兩品種水稻地上部和根系NPT 的含量呈先升后降的趨勢。NPT含量在第5 d 時達到最大值，與其對照相比，欣榮優2045 和優I2009 地上部的NPT 含量分別增加了107%和48%，根系含量增加了1.38 倍和5.13 倍。在第7 d時，兩品種水稻的NPT 含量均顯著下降。在各個Cd處理時間段，欣榮優2045 的NPT 含量（尤其是根系）均高于優I2009。

2.5 Cd脅迫下高低積累型水稻品種間GSH含量的差異

隨Cd 脅迫時間的延長，欣榮優2045 和優I2009體內GSH 含量的變化趨勢差異很大（圖5）。欣榮優2045 體內的GSH 含量呈逐漸上升趨勢，第7 d 時達到最大值，地上部和根系分別為178.43 nmol·g-1和161.97 nmol·g-1，相較于對照分別增加了2.09 倍和1.06 倍；而優I2009 體內的GSH 含量則呈先升后降的變化趨勢，第3 d時達到最大值，地上部和根系分別為118.35 nmol·g-1和149.23 nmol·g-1，相較于對照增加了86%和2.33 倍，第7 d 時，地上部和根系含量分別降為79.97 nmol·g-1和64.48 nmol·g-1，相較于第3 d 分別下降了32%和57%。

2.6 Cd脅迫下高低積累型水稻品種間PCs含量的差異

兩種水稻地上部和根系PCs 含量的變化與NPT含量的變化趨勢一致（圖6）。欣榮優2045和優I2009地上部的NPT 含量在第5 d 時達到最大值，分別為420.35 nmol·g-1和437.76 nmol·g-1，與其對照相比增加了97%和47%；而欣榮優2045 和優I2009 根系的PC 含量分別為720.05 nmol·g-1和508.38 nmol·g-1，與其對照相比增加了1.51 倍和8.37 倍。在第7 d 時，兩個水稻品種的PCs含量均顯著下降。

圖3 Cd脅迫對TBARS含量的影響Figure 3 Effect of cadmium stress on TBARS content

圖4 Cd脅迫對NPT含量的影響Figure 4 Effect of cadmium stress on NPT content

2.7 Cd脅迫下高低積累型水稻品種間GST活性的差異

隨Cd 脅迫時間的延長，兩品種水稻地上部GST活性都呈先升后降的趨勢（圖7），第3 d 時活性均達到最高，為145.90 U·mg-1（欣榮優2045）和146.67 U·mg-1（優I2009），比對照上升了70%（欣榮優2045）和129%（優I2009），第3 d 后GST 活性顯著下降，到第7 d時，下降了31%（欣榮優2045）和51%（優I2009）。

兩品種水稻根系GST活性亦呈先升后降的趨勢，其中GST 活性最大的是第3 d 和第5 d，欣榮優2045的GST 活性分別為287.33 U·mg-1和282.20 U·mg-1，比對照增加了95%和91%；優I2009 的GST 活性分別為264.01 U·mg-1和266.94 U·mg-1，比對照增加了1.11倍和1.13 倍。到第7 d 時，兩品種水稻的GST 活性均顯著下降，相較于第5 d，欣榮優2045 和優I2009 分別下降了36%和50%。

3 討論

同一條件下，不同品種水稻間和不同器官間Cd的吸收和積累存在差異。這種差異主要是由水稻內外部形態結構的差異、不同品種對Cd 的生理生化反應機制以及水稻植株對Cd 吸收轉運機制的不同所致[32]。本研究中，隨Cd 脅迫時間的延長，兩品種水稻對Cd 的吸收積累量為欣榮優2045＞優I 2009，且根部＞地上部，這與我們前期的研究一致[26]。

在Cd 脅迫下，植物體內產生的大量ROS 導致植物體內代謝紊亂。植物細胞產生的H2O2是ROS 的主要產物，其含量可反映機體內脂質過氧化程度和細胞損傷程度，而TBARS 是植株體內脂類過氧化物的最終產物，其含量水平通常可用來反映植株遭受氧化脅迫的水平。隨Cd 脅迫時間的延長，兩品種水稻的H2O2和TBARS 含量逐漸上升，而Cd 低積累品種優I2009 體內的H2O2和TBARS 含量上升的幅度大于欣榮優2045（圖2 和圖3），說明優I2009 受Cd 的毒害作用比欣榮優2045更大。

圖5 Cd脅迫對GSH含量的影響Figure 5 Effect of cadmium stress on GSH content

圖6 Cd脅迫對PCs含量的影響Figure 6 Effect of cadmium stress on PCs content

圖7 Cd脅迫對GST含量的影響Figure 7 Effect of cadmium stress on GST content

為抵御Cd 脅迫，植物體內產生的非蛋白巰基物質（GSH、PCs、Cys 等）絡合Cd 是重要的解毒機制之一[11]。巰基物質與Cd 形成的絡合物減少了細胞質中自由Cd離子的濃度，或將其運輸到液泡中區隔，形成區室化作用[21-22，33]。GSH是植物體內重要的抗氧化劑和信號物質[11]，是在生物體胞內代謝過程和遭受氧化脅迫時產生的H2O2的最有效清除劑之一[34]。本研究中，隨Cd 脅迫時間的延長，欣榮優2045 的GSH 含量逐漸上升，與H2O2活性呈正相關，而優I2009 表現出先升后降的趨勢，說明欣榮優2045 在清除活性氧的功能方面表現出更強的解毒能力，而優I2009在Cd脅迫前期表現出對Cd 脅迫的應激反應，但在Cd 脅迫后期可能是因為過多ROS 的生成超出了其清除范圍，因此GSH含量逐漸下降。兩品種水稻隨Cd脅迫時間的延長，NPT 和PCs 含量呈先上升后下降的趨勢，說明Cd 脅迫后水稻幼苗可通過誘導前期（1～5 d）NPT和PCs 的合成來減輕Cd 對水稻幼苗的毒害作用，這屬于水稻幼苗應對Cd脅迫的自救機制。并且欣榮優2045的NPT含量高于優I2009，說明Cd高積累型品種合成更多的NPT 與Cd 絡合，解毒能力更強[25]。Cd 脅迫后期，NPT 和PCs 的含量下降，可能的原因是隨Cd脅迫時間的延長，Cd 引起的過氧化損傷不斷加劇，打破了植物體內ROS 產生和清除的動態平衡，使其誘導NPT 和PCs合成的能力下降，說明兩種水稻NPT 和PC的合成能力存在一個Cd脅迫時間的閾值。

GST是生物體內重要的解毒酶，與GSH代謝密切相關，可保護細胞免受Cd的毒害[20]。GST還具有過氧化物酶的功能，能平衡H2O2的產生和清除[35]。本研究中，兩品種水稻隨Cd 脅迫時間的延長，GST 活性呈先上升后下降的趨勢，因為在Cd脅迫下，H2O2等活性氧不斷生成，而在植物防御機制中起著重要作用的GST活性也隨之升高，以減輕Cd 的毒害作用，但隨Cd 脅迫時間的延長，GST 活性下降，表明水稻抗氧化系統對Cd 的耐受性有一定的時間限值，超過這一時間限值時，未被清除的活性氧會對細胞產生不可逆的損傷，GST 的解毒作用被抑制，致使其酶活性下降。通過比較兩品種水稻的GST 活性（圖7）發現，同一時間段欣榮優2045 高于優I2009，說明不同Cd 積累型水稻的GST 活性對Cd脅迫的應答機制存在一定的基因型差異，這可能與兩品種GST 同功酶的組成、表達和功能不同有關[20，36-37]。

4 結論

隨Cd 脅迫時間的延長，兩品種水稻的H2O2和TBARS 含量逐漸增加，同時也不同程度地刺激了兩品種水稻NPT（包括GSH 和PCs）的合成和GST 的生成，且Cd 低積累型品種優I2009 遭受的氧化脅迫水平和膜脂過氧化程度大于Cd 高積累型品種欣榮優2045。但是，當Cd 脅迫超過一定的時間限值時，兩品種水稻所合成的NPT 和生成的GST 活性均被抑制。此外，Cd 高積累型水稻品種欣榮優2045 可以通過合成更多的NPT 與Cd 絡合來清除活性氧，相較于Cd 低積累型水稻品種，優I2009 表現出更強的解毒能力。