轉基因斑馬魚在鎘免疫毒性研究中的應用

趙 爽，段鑫越，王 嬌，馮一凡，王予頔，宮知遠，端正花*

（1.天津理工大學環境科學與安全工程學院，天津300384；2.新加坡國立大學生命科學學院，新加坡117543）

隨著工業及社會的快速發展，水體重金屬污染已經成為全球范圍內最嚴重的環境問題之一[1]。由于工業廢水的違法排放，造成鎘、砷、汞等多種重金屬離子進入水體[2]。重金屬具有富集性并且難以自然降解，在水體中積累到一定限度就會對水體-水生植物-水生動物系統造成嚴重危害，并可能通過食物鏈直接或者間接影響到人類自身健康[3-4]。水體中重金屬污染物通常以很低濃度水平存在[5-6]。近年來，大量基于魚類、蚤類、藻類及處于不同營養級的微生物的毒性測試方法開始建立并迅速發展，為水體環境中低濃度污染物的毒性生物測試提供了可能[7]。但是以上這些方法都存在實驗周期長、操作復雜的缺點。斑馬魚（Danio rerio）是環境毒理學中常用的標準生物模型[8]，與人類基因組相比其基因的保守性約為87%。轉基因斑馬魚技術檢測方法在此基礎上進一步發展，該檢測技術快捷簡單，可在活體上直接進行，因此能夠觀察到某一個體在環境污染物的干擾下整個連續生命周期的發展變化，從而可以為水環境污染檢測提供更快速、直觀的證據，彌補了傳統水質毒性評價方法的不足[9]。

免疫毒性是重金屬毒性作用機制的一個重要方面。如重金屬鎘對動物機體具有廣泛的損傷作用，尤其是免疫系統[10]。在哺乳動物及魚類血液的非特異性細胞免疫系統中，中性粒細胞都起著十分重要的作用，當發生炎癥時，中性粒細胞會被誘導和遷移到感染部位[11-12]。利用溶菌酶（lysozyme C，lyz）標記轉基因斑馬魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish血液中的中性粒細胞，如果斑馬魚受外源化合物影響導致體內發生炎癥反應，中性粒細胞則會遷移到該部位，表征為熒光量表達增強，進而可以便捷地找出炎癥相關的靶器官。鄒玉[13]在研究中也發現不同濃度的內毒素（LPS）會誘導斑馬魚Tg（lfap：EGFP；lyz：DsRED2）紅色熒光標記的中性粒細胞和巨噬細胞向肝臟部位遷移聚集。本研究以轉基因斑馬魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish為模型，以重金屬鎘為研究對象，擬建立速度快、特性強的重金屬免疫毒性檢測技術，進而為環境中重金屬的免疫毒性健康風險和生態風險提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗中氯化鎘（CdCl2）為分析純，購于Sigma-Aldrich 公司。稱取一定量的粉末溶于重組水中，稀釋到需要的濃度。根據水體環境中重金屬的實際濃度和預試驗結果，本試驗中CdCl2的暴露濃度為0（空白對照）、0.01、0.1、1 μmol·L-1。

實驗室自培育成年野生斑馬魚和轉基因斑馬魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish，雌雄比1∶2，每日喂食活鹵蟲芽苗（Aremiamauplii，World Aquafedds，USA）1 次，于（26±1）℃光照/黑暗（14 h/10 h）周期條件下培養1個月，開始采集魚卵。飼養用水經生物過濾器過濾并充分曝氣，pH值保持約8.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 毒性暴露

將轉基因斑馬魚種魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish與野生型斑馬魚種魚進行雜交，得到斑馬魚魚卵。在24 孔細胞培養板中加入一定濃度的上述溶液，并于每孔中加入2 mL 試液和1 枚經過挑選發育良好的受精卵，進行零時（卵產出并受精1 h內，0 hpf）染毒。人工氣候箱培養6 d 后，觀察致死和中毒反應，培養過程中每2 d 更換一次溶液。胚胎發育期間的毒性觀察指標有24 h 血流障礙（顯微鏡下未觀察到有血液流動作為血流障礙判斷標準）、52 h 死亡數（以無心跳作為死亡判斷標準）和52 h 孵化抑制（以未破胚胎絨毛膜作為孵化抑制的判斷標準）。實驗設置3 個平行。

培養到第6 d，在熒光顯微鏡下篩選各暴露組具有熒光表達的斑馬魚幼魚，并將其進行麻醉、固定成相同的姿勢，利用熒光顯微鏡（ZEISS Axiovert 200M）觀察幼魚中熒光表達，并利用數碼相機（ZEISS，Axioc Cam HRC）在相同放大倍數和曝光時間下拍照記錄熒光表達量。每個暴露濃度和空白對照組記錄10 條轉基因斑馬魚的熒光量。

1.2.2 相關基因表達分析

根據毒性暴露結果，將0.1 μmol·L-1CdCl2溶液加入到10 cm 玻璃表面皿中，每孔加入20 mL 試液和50枚挑選過的發育良好的雜交斑馬魚魚卵，在人工氣候箱培養6 d 后，每暴露組取1 個表面皿中所有仔魚樣品作為1 個樣本，用液氮冷凍，于1.5 mL 離心管中-20 ℃冷凍保存。試驗設置空白對照組。總RNA利用Trizol（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，US）方法提取，通過測定OD 值和1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 的濃度和質量。根據課題組前期研究結果[14]，選擇斑馬魚金屬硫蛋白相關基因（zMT、dMT）、炎癥相關基因（serp、tnf）和癌癥相關基因（ccgn1、chk2、p53）作為研究對象，以β-Actin基因為內參，采用Primer 5.0 軟件設計引物，具體功能與擴增引物序列如表1 所示。按照常規方法取3 μg 上述總RNA 反轉錄成cDNA，利用LightCycle 480（Roche Applied Science）設備及配備的試劑盒（Roche Applied Science）進行實時定量RT-PCR 分析。每個樣品均設置4 個平行，2-ΔΔCT方法計算相對表達量，最終結果用暴露組基因表達量相對空白組基因表達量比例的形式表示。

表1 待測基因引物序列Table 1 Primer sequences of target genes

1.3 統計分析

胚胎發育各個毒性指標和基因表達量的最終結果以平均值±s.d.的形式表達，以SPSS 19.0（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）軟件作圖。對照組與各暴露組間的差異用student-t進行檢驗，P＜0.05表示組間有顯著差異，P＜0.01表示組間有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 CdCl2暴露對轉基因斑馬魚胚胎發育的影響

與空白實驗組相比，CdCl2對轉基因斑馬魚胚胎發育主要有24 h血流障礙、52 h死亡數和52 h孵化抑制3 個毒性效應。如圖1 所示，0.01 μmol·L-1CdCl2即可顯著抑制轉基因斑馬魚胚胎的孵化（P=0.013）。隨著暴露濃度的增大，斑馬魚胚胎24 h血流障礙和52 h孵化抑制這兩個毒性效應都顯著增強，其中CdCl2在52 h 孵 化 抑 制 指 標 的EC50為0.05 μmol·L-1（R2=0.991）。當CdCl2的濃度高達1 μmol·L-1時，斑馬魚胚胎的死亡率顯著增大到12.5%（P=0.025）。

2.2 CdCl2暴露對轉基因斑馬魚免疫毒性的影響

轉基因斑馬魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish利用溶菌酶標記了斑馬魚血液中的中性粒細胞，不同濃度CdCl2暴露下Lyz fish仔魚中的中性粒細胞熒光量表達及其分布如圖2所示。

圖1 不同濃度CdCl2作用下轉基因斑馬魚胚胎發育毒性Figure 1 Development toxicity by different concentrations of CdCl2 in transgenic zebrafish embryos

圖2 不同濃度CdCl2誘導下轉基因斑馬魚體內熒光表達Figure 2 The fluoresce expressions in transgenic zebrafish induced by CdCl2

0.01 μmol·L-1CdCl2誘導下的斑馬魚仔魚血管內熒光表達量高于空白對照組，表示斑馬魚仔魚血管內的中性粒細胞數量增多。0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1CdCl2暴露下，不僅斑馬魚仔魚血管內熒光表達量進一步增強，而且還可以顯著看到紅色熒光在斑馬魚肝臟部位聚集。因此，CdCl2能夠誘導斑馬魚仔魚發生炎癥作用，血液和肝臟是其主要靶器官。

2.3 CdCl2暴露對斑馬魚仔魚標志基因表達的影響

為進一步探討CdCl2對斑馬魚仔魚免疫毒性的機制，試驗對比研究了0.1 μmol·L-1CdCl2暴露下斑馬魚體內金屬硫蛋白相關基因（zMT、dMT）、炎癥相關基因（serp、tnf）和癌癥抑制相關基因（chk2、ccnc、ccgn1）這3組功能基因的表達，結果如圖3 所示。0.1 μmol·L-1CdCl2顯著誘導了金屬硫蛋白相關基因dMT的表達，dMT基因表達量約為空白對照組的3 倍（P=0.001），而金屬硫蛋白相關基因zMT的表達則與空白對照組無顯著差異（P=0.253）。炎癥相關基因（tnf、serp）在轉基因斑馬魚仔魚體內也顯著上調，分別為空白對照組的1.347 倍（P=0.001）和1.778 倍（P=0.025）。而癌癥相關基因（chk2、ccng1和p53）的表達在0.1 μmol·L-1CdCl2暴露下都顯著受到抑制，表達量分別為空白對照組的0.092、0.816 和0.596，其中chk2基因表達量受到的抑制更為顯著（P=0.030）。

圖3 0.1 μmol·L-1 CdCl2誘導下斑馬魚仔魚相關基因表達Figure 3 Expressions of related genes in transgenic zebrafish induced by 0.1 μmol·L-1 CdCl2

3 討論

3.1 轉基因斑馬魚在環境污染物毒性檢測中的應用

轉基因斑馬魚是將外源基因通過顯微注射等方式導入斑馬魚受精卵，注射的外源基因能夠整合到斑馬魚受精卵的基因組中，從而建立具有穩定遺傳特性的轉基因品系。熒光標記不同組織（肝臟、心臟、腎臟等）、細胞（神經細胞、免疫細胞）的多種轉基因斑馬魚品系的出現，促進了斑馬魚在遺傳學、發育生物學、細胞生物學、醫學水產育種學等研究領域的廣泛應用[15-16]。近年來轉基因斑馬魚也在迅速發展，在環境毒理學方面也體現出一定的價值[17-18]。如Brion 等[19]構建了轉基因斑馬魚品系cyp19a1b-GFP用于評估歐洲廢水的內分泌干擾活性。孫冰等[20]構建了Tg（erevtg：egfp）轉基因斑馬魚，可直觀地動態監測水體環境中內分泌干擾物的污染情況。紀喜文等[21]利用芳香烴反應元件AHRDtk構建的新型轉基因斑馬魚，可以直觀判斷水體環境中是否有該類化學物質存在。

本研究發現，0.01 μmol·L-1CdCl2即可顯著抑制轉基因斑馬魚胚胎的孵化，0.1 μmol·L-1CdCl2能夠導致轉基因斑馬魚胚胎發生血流障礙。這與作者前期在野生型斑馬魚胚胎發育中得到的結果一致[14]。但是通過轉基因斑馬魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish可以直觀地看到在0.01 μmol·L-1和0.1 μmol·L-1CdCl2暴露下，斑馬魚仔魚體內的中性粒細胞數量增多且趨向于肝臟，肝臟是CdCl2作用的主要靶器官之一。這也得到了作者前期結果的驗證，即在利用轉基因斑馬魚Tg（lfabp10a：dsRed；elaA：EGFP）探討CdCl2的肝臟毒性時發現，0.1 μmol·L-1CdCl2單獨暴露使斑馬魚肝臟發生炎癥作用，肝臟相對空白對照顯著膨大，1 μmol·L-1CdCl2則顯著抑制斑馬魚肝臟發育[9]。

環境污染物作用于機體時，機體免疫系統功能常在早期就發生變化。因此，免疫轉基因斑馬魚的發展對于提高環境污染物檢測的靈敏度和及時采取預防措施具有重要意義[22]。目前我國免疫轉基因斑馬魚的應用主要側重在醫學領域。如陳將飛等[23]通過免疫轉基因斑馬魚MPO研究發現免疫抑制劑雷帕霉素（RAP）暴露能夠顯著抑制斑馬魚體內免疫細胞（中性粒細胞）的熒光表達。王榮春等[24]發現氯霉素對免疫轉基因斑馬魚Lyz幼魚的致畸和致死作用具有劑量、時間依賴性，并可以導致斑馬魚幼魚的免疫細胞數量減少。免疫轉基因斑馬魚在環境領域的應用還鮮有報道，本研究利用免疫轉基因斑馬魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish模型探討了Cd 的免疫毒性效應，得到了顯著的劑量-效應關系。

3.2 Cd對斑馬魚造成免疫毒性的作用機制

化合物個體有害效應產生的機理可以由一種信號路徑（Pathway）作用或幾種信號路徑共同作用分析得出。Cd 的重要作用機理則是與含巰基、氨基、羧基的蛋白質分子結合形成鎘結合蛋白，使許多酶系統的活性受到抑制和破壞[25]。Cd 對斑馬魚仔魚造成損傷的途徑可能有氧化性損傷、代謝紊亂、炎癥、細胞凋亡等，進一步作用則可能發生癌變。在這些復雜的信號傳遞過程中，與其相關的基因表達可能發生變化。反之，通過研究特定基因表達的變化，則可推斷該化合物造成毒性的作用途徑。例如在4-NP的氧化性壓力下，斑馬魚腫瘤抑制相關基因rb和p53的表達顯著增強[26]。

本研究通過金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）、炎癥和癌癥抑制相關基因這3 類功能共7 個基因的表達，探討了0.1 μmol·L-1CdCl2誘導下斑馬魚仔魚免疫毒性的可能機制。金屬硫蛋白MT 是重金屬暴露下生物體內的防御者。如研究證實生物體中MT 通過與Cd 螯合從而降低Cd 的毒性，并且MT 能夠在細胞不同周期抵御重金屬造成的DNA 損傷和細胞凋亡[27]。Bonaventura 等[28]也 研究發現Cd 暴 露刺激下 骨細胞炎癥與MT 的過度表達有顯著相關性。本研究也發現0.1 μmol·L-1CdCl2暴露顯著誘導了轉基因斑馬魚MT相關基因dMT的表達。

環境污染物致癌是一個相當復雜的過程，其機理可能涉及污染物通過直接和各種間接途徑產生遺傳性損傷，通過干擾細胞信號傳導系統誘導原癌基因和蛋白的表達，以及抑制機體免疫防御功能等許多方面。免疫系統是生物異源物質毒性效應的主要靶系統之一。在癌癥形成過程中，免疫炎癥也發揮著重要的調節作用。例如，人體肺細胞（BEAS-2BR細胞）在Cd 暴露下激活了tnf-α、nf-κb及cox-2基因和蛋白的表達，從而產生炎性微環境，這與肺癌的發生有密切關系[29]。大鼠小腸上皮（IEC-6）細胞在Cd 的慢性暴露中，不僅降低了抑癌基因p53的表達水平，而且還降低了UBE2D家族基因的表達[30]。因此研究免疫系統的變化，不僅可以對癌癥起到預警作用，還可以從機制上尋求癌癥發生的可能途徑。本研究發現0.1 μmol·L-1CdCl2暴露顯著誘導了轉基因斑馬魚炎癥相關基因（serp、tnf）的表達，抑制了癌癥抑制相關基因（ccgn1、chk2、p53）的表達。因此，Cd 對轉基因斑馬魚免疫毒性的機制與上述基因表達的變化具有一定的相關性，并且0.1 μmol·L-1CdCl2暴露對斑馬魚仔魚具有致癌風險。

4 結論

（1）0.01 μmol·L-1CdCl2對斑馬魚胚胎產生發育毒性，并且能夠暴露顯著誘導轉基因斑馬魚的免疫毒性。

（2）Cd 免疫毒性的機制與其誘導金屬硫蛋白相關基因（dMT）、炎癥相關基因（serp、tnf）的表達及抑制癌癥相關基因（ccng1、chk2、p53）的表達有關。