納米銀對土壤固氮微生物群落結構及固氮活性的影響

伍玲麗，楊玉蓉，張 麗，劉小紅，司友斌

（安徽農業大學資源與環境學院，農田生態保育與污染防控安徽省重點實驗室，合肥230036）

納米銀（AgNP）與傳統的銀顆粒相比具有耐高溫、電導率高和電阻率相對較低等理化性質以及抗菌特性，因此在食品包裝、個人護理品和其他產品中得到了廣泛的應用[1-2]。據統計，目前全球對AgNP 的消費高達5.5～550 t·a-1[3]。然而，AgNP 的廣泛使用增加了其釋放到環境中的風險，環境中的AgNP 顆粒通過大氣沉降、污水灌溉、垃圾填埋等方式最終匯集于土壤，預測AgNP在土壤中每年可增加1.2～2.3 ng·kg-1[4]。美國EPA 調查推測，10 年后農田土壤中AgNP 可累積到10 mg·kg-1[5]。從2013 年開始，AgNP 的環境毒性引起了廣泛的關注[6]。研究表明AgNP 對土壤微生物具有毒害作用[7-9]。

氮循環是影響陸地生態系統生產力可持續性發展的重要物質循環[10]。其中，固氮微生物在調節土壤氮素轉化中起著關鍵作用。生物固氮是陸地及其他環境中氮素最主要的天然來源[11]，生態系統中絕大多數生物可利用形式的氮主要來源于土壤固氮微生物群落（如藍細菌、假單胞菌、固氮螺菌和固氮菌）的生物固氮作用[12]。它們通過固氮酶將大氣N2轉化為植物有效氮，從而為生態系統提供額外的氮源[13]。其中nifH基因編碼的固氮酶普遍存在于固氮微生物中[14]。編碼這種酶的nifH基因在細菌和古細菌結構域中高度保守，可為研究固氮菌群落提供依據，因此已被廣泛用作研究固氮微生物多樣性和豐度的遺傳標記物[15]。

AgNP的毒性機制主要有：與細胞膜相互作用，損傷細胞結構；造成細胞內活性氧（ROS）累積，導致細胞氧化損傷；AgNP或釋放的Ag+穿透細胞膜進入細胞內部，破壞DNA復制等[16-19]。但關于AgNP釋放的Ag+的毒性大小一直存在爭議。前期研究發現，AgNP 和Ag+對土壤中硝化微生物及其氨氧化速率都有負面影響，但Ag+的影響程度比AgNP 低[20]。有研究表明Ag+的毒性具有即時性，而AgNP 的毒性具有長期性[21]。目前，關于AgNP 對土壤固氮微生物的影響研究較少，尤其是自生固氮作用。自生固氮菌容易受到溫度、水分和養分等環境因素的影響。此外，重金屬也會造成固氮菌群數量的改變[22]。Kumar等[23]發現AgNP、納米銅（CuNP）、納米硅（SiNP）對極地土壤微生物均產生毒害作用，其中AgNP 能顯著抑制固氮菌的活性。Arnaout 等[24]研究也證實AgNP 可擾亂土壤中的氮循環。釋放到土壤環境中的AgNP 可能對土壤固氮產生負面作用，因此有必要研究AgNP 對土壤固氮微生物及固氮作用的影響。

本文針對AgNP 的環境暴露，利用高通量測序技術比較了不同濃度10 nm 的AgNP（10、25、50 mg·kg-1）和50 nm 的AgNP（25、50、100 mg·kg-1）暴露對土壤固氮微生物多樣性及群落組成的影響，并對AgNP暴露下土壤自生固氮菌數量以及固氮酶活性進行了測定，以期為AgNP 的土壤微生物效應及對氮循環影響的研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試材料

10 nm的AgNP購于南京先豐納米有限公司，平均粒徑為10±5 nm，形態如圖1A所示。50 nm的AgNP購于南京埃瑞普納米材料有限公司，平均粒徑為50±5 nm，形態如圖1B所示。

圖1 兩種粒徑納米銀透射電鏡圖Figure 1 Transmission electron microscope（TEM）images of AgNP of two sizes

表1 土壤樣品的基本理化性質Table 1 Basic physical and chemical properties of measured soil

1.1.2 土壤樣品采集及培養

供試土壤為黃褐土，采自安徽省合肥市包河區大圩鎮（31°46′ N，117°22′ E），采樣深度為0～20 cm。土壤采集后取出其中的植物根和殘葉，過20 目篩備用。土壤理化性質的測定參見《土壤農化分析》[25]，測定結果如表1 所示。將新鮮土壤過20 目篩后放置于30 ℃恒溫箱中預培育7 d。將兩種粒徑的AgNP 與少量風干土混合后再與培育后的約100 g 鮮土混合均勻，土壤中10 nm 的AgNP（nAg10）終濃度為10、25、50 mg·kg-1，50 nm 的AgNP（nAg50）終濃度為25、50、100 mg·kg-1。將混合后的土壤樣品放于30 ℃的恒溫箱中培養，調節土壤含水量至田間最大持水量的60%，定時取樣，每組3個重復。

1.2 AgNP對土壤固氮微生物群落結構的影響

1.2.1 土壤樣品前處理

稱取200 mg 兩種粒徑AgNP 最高劑量暴露7 d（nAg10S 和nAg50S）和90 d（nAg10L 和nAg50L）的土壤，將其放入滅菌后的2 mL 離心管中，并加入1 mL 70%的乙醇，混合均勻后高速（10 000 r·min-1）離心3 min，去除上清液。加入磷酸緩沖液（PBS），以相同的轉速離心3 min 后再倒去上清液。最后將離心管于55 ℃烘10 min，使殘留乙醇完全揮發。同時未添加AgNP的土壤作為對照組（CK）。

1.2.2 土壤DNA的提取及PCR擴增

按照E.Z.N.A Mag-Bind Soil DNA（OMEGA）試劑盒進行土壤微生物總DNA 的提取，用nifH基因作為特異性引物[15]。定量PCR 反應體系為：2×Taq master Mix 15 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，Genomic DNA 10～20 ng，加dd H2O 至30 μL。PCR 擴增引物及反應條件見表2。

1.2.3 Illumina Miseq測序及生物信息學分析

DNA 純化回收和定量混合后利用Illumina Miseq測序平臺進行高通量分析，上機前保證其終濃度為20 pmol·L-1。測序服務委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。高通量測序得到的雙端序列數據使用FastQC 進行質量控制，去除低質量序列和嵌合體序列。OTU（Operational taxonomic units）指人為給每個分類單元設置的同一標志，通常對97%相似水平下的OTU 進行生物信息統計分析[26]。使用Usearch進行OTU 聚類，然后根據樣本分析所得OTU 情況使用QIIME（Quantitative insights into microbial ecology）中的alpha_diversity分析模塊進行Alpha多樣性分析。

1.3 土壤自生固氮細菌數量測定

AgNP 處理7、28、60、90 d 后，選擇Ashby 培養基，采用MPN 稀釋法測定土壤自生固氮菌的數量[27]。培養基成分如下：甘露醇10.0 g，KH2PO40.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，蒸餾水1000 mL，調節pH至6.8～7.0。

1.4 土壤固氮活性測定

根據固氮微生物體內的固氮酶可將C2H2還原為C2H4的能力，采用C2H2還原法測定土壤的固氮作用，固氮酶活性由每克干土每小時乙稀產生的納摩爾數（nmol·h-1·g-1）來表示[28]。將兩種粒徑AgNP 暴露后的土壤（20 g）放入無菌氣密玻璃瓶中，用葡萄糖調節土壤含碳量使其達到1 mg·g-1，用純C2H2氣體（99.99%）代替10%的瓶內空氣（10 mL）。將所有土壤樣品在28 ℃下溫育48 h，并使用氣相色譜（GC-7890B，安捷倫，美國）測定C2H4濃度。檢測器為FID，色譜柱為Agilent 19095P-Q04 HP-plot，毛細管柱為30 m×0.350 mm×40 μm，檢測條件為檢測器溫度150 ℃，柱溫40 ℃，進樣溫度150 ℃，載氣為N2，燃氣為H2，空氣流速為400 mL·min-1。

1.5 數據處理

數據采用SPSS 19.0 進行統計分析，并對不同處理間的數據采用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較進行顯著性差異檢驗，Origin 9.0和R語言程序包（Venn 圖采用VennDiagram 軟件包，熱圖采用pheatmap軟件包）作圖。

2 結果與分析

2.1 AgNP 暴露下土壤固氮微生物OTU 數量及Venn圖分析

AgNP 暴露下土壤固氮微生物OTU 數量變化如圖2A 所示，未添加AgNP 的土壤固氮微生物的OTU數目最多，所含的微生物種類最豐富，兩種粒徑不同濃度AgNP 暴露下土壤固氮微生物數量均有所下降。圖2B 中CK 組土壤特有OTU 的數目為2166，nAg10S、nAg10L、nAg50S 和nAg50L 各處理組的土壤獨有OTU數目分別為683、768、784 和1144。10 nm 和50 nm 的AgNP 暴露7 d 和90 d 后土壤固氮微生物OTU 數量差異不顯著。

表2 PCR擴增引物及反應條件Table 2 PCR amplification primers and reaction conditions

2.2 AgNP 暴露下土壤固氮微生物的主要組成及豐度變化

熱圖根據顏色的深度來定義群落分布豐度，結果更直觀，更清晰。屬水平上豐度前10 的物種熱圖分析見圖3。橫向是固氮微生物根據進化關系的聚類分支，其中CK 組獨為一類，將nAg50S 組和nAg50L 組先歸并，再與nAg10L 組聚合為另一類，繼而又與nAg10S 組歸并。CK 組土壤樣品微生物群落結構與nAg10S、nAg10L、nAg50S 和nAg50L 組差異較大。另外，從圖中可以看到，CK組土壤相對豐度最高的菌屬依次為慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、流行桿菌屬（Vulgatibacter）和厭氧黏細菌屬（Anaeromyxobacter）。AgNP 暴露后這些微生物的豐度明顯降低，而固氮弧菌屬（Azoarcus）的豐度卻大幅上升，與CK 組差別較大，說明AgNP 的暴露引起了固氮微生物群落結構的改變。

圖2 納米銀暴露下土壤微生物OTU數量分布圖及OTU的Venn圖分析Figure 2 Quantitative distribution of soil microbial OTU and Venn diagram representation of the OTU under the exposure of AgNP

圖3 納米銀暴露下土壤固氮微生物物種豐度熱圖Figure 3 Heat map of soil nitrogen fixing microbial species abundance under the exposure of AgNP

2.3 AgNP暴露下土壤固氮微生物多樣性分析

納米銀對土壤固氮微生物多樣性的影響見表3。Chao 指數和Ace 指數常用來分析微生物群落的豐富程度。Shannon 指數和Simpson 指數用來估算樣品中微生物的多樣性，其中Shannon 值越大，說明這個群落的多樣性越高，而Simpson值則相反。Coverage指樣本庫的覆蓋水平[12]。從表3中可以發現，CK組的土壤固氮微生物的多樣性最高，其次是nAg50L 組和nAg10L組，nAg10S 組的土壤固氮微生物多樣性最低，這與各處理的OTU 數目比較分析結果相似，說明AgNP 改變了土壤固氮微生物群落，造成其多樣性下降。

表3 納米銀對土壤固氮微生物多樣性的影響Table 3 Effects of AgNP on nitrogen-fixing microbial community diversity

2.4 AgNP對土壤自生固氮菌數量的影響

兩種粒徑的AgNP暴露下土壤自生固氮菌數量變化如圖4 所示。nAg10（10、25、50 mg·kg-1）暴露28 d后，土壤自生固氮菌數量減少了18.96%～47.28%；nAg50（25、50、100 mg·kg-1）暴露28 d后土壤自生固氮菌數量減少了17.42%～27.78%；兩種粒徑AgNP 暴露90 d 后，土壤自生固氮菌數量總體上分別下降了29.51%～51.04%和20.83%～24.47%。隨著暴露時間的延長，AgNP 對土壤自生固氮菌數量影響減輕，且nAg10 對土壤固氮菌表現出更強的抗菌活性，說明AgNP對自生固氮菌的影響與其暴露時間和尺寸有關。

2.5 AgNP對土壤固氮酶活性的影響

從圖5 可以看出，CK 組土壤固氮酶活性最高，AgNP 暴露下土壤固氮酶活性均受到不同程度的影響，尤其是培養后期，土壤固氮酶活性明顯降低。nAg10（50 mg·kg-1）和nAg50（100 mg·kg-1）暴露28 d后土壤固氮酶活性分別降低8.54%和6.76%。隨著AgNP 暴露時間的延長，土壤固氮酶活性繼續降低。第90 d 時，與CK 組相比，nAg10（10、25、50 mg·kg-1）處理組土壤固氮酶活性下降了14.55%～27.47%，nAg50（25、50、100 mg·kg-1）處理組土壤固氮酶活性降低了17.87%～21.79%。

圖4 兩種粒徑納米銀暴露下土壤自生固氮菌數量Figure 4 Variation of azotobacter number under two sizes of AgNP exposure

圖5 兩種粒徑納米銀暴露下土壤固氮酶活性變化Figure 5 Variation of soil nitrogenase activites under two sizes of AgNP exposure

3 討論

土壤微生物在維持土壤功能方面發揮著重要作用，如分解有機物和將無機氮轉化為有機氮等[29]。自然生態系統和傳統農業生產中的氮循環主要依賴于固氮微生物的生物固氮作用，因此確定AgNP 對土壤微生物及其功能的影響尤為重要。本研究基于固氮微生物功能基因nifH的高通量測序分析結果，表明AgNP 暴露導致土壤固氮微生物數量和OTU 數量降低，改變固氮微生物的群落結構。沒有添加AgNP 的土壤中Bradyrhizobium為優勢菌屬，其相對豐度也較高。而AgNP 暴露后Azoarcus變為優勢菌屬，且其相對豐度明顯高于其他菌群。Chunjaturas 等[30]也發現AgNP暴露會改變土壤微生物群落組成。Ge等[31]同樣發現不同劑量納米二氧化鈦（TiO2NP）和納米氧化鋅（ZnONP）暴露均改變了土壤微生物群落構成，且群落多樣性及土壤中微生物數量均減少。

固氮細菌對環境因素變化極其敏感，在兩種粒徑AgNP 短期暴露下土壤自生固氮菌數量下降非常明顯。另外，隨著AgNP 暴露時間的延長，各處理組自生固氮菌數量下降趨勢變緩。出現這種現象可能是由于AgNP 添加到土壤后，隨著其暴露時間的延長，激發了微生物體內的自我保護機制，如產生細胞胞外蛋白質或多糖等物質來緩解AgNP 的毒性；另外也可能是AgNP 進入土壤后與有機物、黏土礦物等物質相互作用，使得AgNP 發生團聚現象且釋放的Ag+減少，影響了其毒性[32]。除此之外，由于土壤氧化還原電位等因素還會促使一部分AgNP 顆粒形成銀的硫化物[33]，使其毒性降低。也有研究表明，土壤中AgNP轉化的Ag2S 具有生物可利用性，能在不同的生物體中引起毒性效應[34]。

乙炔還原試驗結果表明AgNP 抑制土壤固氮酶活性，但主要發生在AgNP 的暴露后期，這可能是因為土壤固氮作用是一個緩慢的過程[35]。Grün 等[32]研究發現，0.01～1 mg·kg-1AgNP 暴露一年后對土壤微生物量、固氮微生物豐度、酶活性和功能基因表達具有負面作用，影響土壤氮循壞。孫影等[36]研究了不同劑量TiO2NP 暴露下對不同類型土壤中氮轉化相關細菌活性的影響，發現其抑制了土壤自生固氮菌的活性。本研究發現AgNP 造成土壤固氮作用下降，這一方面可能由于AgNP 釋放的Ag+的作用，另一方面可能是因為AgNP 自身影響了土壤中的固氮微生物活性從而影響固氮作用。AgNP進入土壤后會釋放出一定量的Ag+，Ag+與土壤微生物作用而影響酶的活性[37]。同劑量AgNP 和Ag+處理下，AgNP 對土壤硝化作用的抑制效果更顯著[23]。另外，Ag+對土壤微生物及酶活性在短期內作用效果明顯，而AgNP 對土壤微生物的毒性發生在暴露后期，其毒性更具持久性[38]，AgNP 的毒性部分來自釋放的Ag+，部分由于本身的特異抗菌性。前期實驗室模擬培養條件下發現小粒徑的AgNP 對固氮菌具有更強的抑制作用[39]，但在土壤環境中兩種粒徑AgNP 對土壤固氮微生物的毒性無顯著差異，這可能是由于土壤系統比實驗室模擬環境復雜，其緩沖作用較強。

雖然本研究發現AgNP 暴露下土壤固氮微生物的種類減少，多樣性及豐度降低，群落組成發生明顯變化，土壤自生固氮菌數量和土壤固氮酶活性在Ag-NP暴露后均受到不同程度的影響，對AgNP的土壤環境風險評價具有一定的貢獻。但是關于AgNP 對土壤固氮微生物代謝途徑的影響以及與固氮酶的結合方式等尚不清楚，還有待進一步的研究。

4 結論

（1）AgNP 作用下土壤固氮微生物多樣性明顯降低，其群落結構組成也發生顯著變化。與對照組相比，50 nm 的AgNP 暴露90 d 土壤固氮微生物群落結構差別最小，10 nm 的AgNP 暴露7 d 土壤固氮微生物群落變化最大。

（2）兩種粒徑AgNP 暴露后土壤自生固氮菌數量均下降，但隨著AgNP 暴露時間的延長，下降趨勢變緩。

（3）土壤固氮酶活性隨著AgNP 暴露時間的延長而降低，AgNP暴露后期對土壤固氮酶活性影響較大。AgNP的抑制作用與其粒徑、濃度以及暴露時間有關。