長期咸水滴灌對土壤氨氧化微生物豐度和群落結構的影響

馬麗娟，張慧敏，侯振安，閔 偉

（石河子大學農學院農業資源與環境系，新疆 石河子832000）

氮肥一般是作物生長的限制性因素，在鹽漬化土壤中合理施用氮肥可有效降低鹽分對作物生長的危害。硝化作用是土壤氮循環的重要環節，在氮素形態轉化和氮循環過程中起著至關重要的作用，直接影響環境質量和氮肥的利用效率[1]。氨氧化作用和亞硝酸氧化作用是硝化作用的兩個關鍵步驟，其中氨氧化作用是硝化作用的限速步驟，主要是在氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB）的參與下完成[2]。隨著分子生物學的不斷發展，人們對于AOA 和AOB 的研究不斷深入。越來越多的學者關注不同環境條件對AOA、AOB 豐度[3]和群落結構組成的影響[4]，以及AOA和AOB對硝化作用的相對貢獻等[5]。

氨氧化微生物的生長受土壤環境的影響。其中土壤鹽分是影響氨氧化微生物生長和群落結構的重要因素。有研究發現AOB和AOA的豐度與鹽度呈負相關[6]，鹽分會抑制AOB 的生長，對AOA 豐度影響不顯著[7]。但是也有研究發現高鹽分可以促進AOA 和AOB 的生長[8]。Caffrey 等[9]研究也表明河口沉積物中AOA 豐度隨著鹽分的增加而增加，但鹽分對AOB 沒有影響。Mosier 等[10]研究發現AOB 豐度隨著土壤鹽度的增加而增加，在低鹽度條件下AOAamoA的基因豐度高于AOB 基因。此外，有研究發現在鹽堿地中AOBamoA基因豐度比AOAamoA基因豐度高兩個數量級[11]。以上研究結果表明鹽分對氨氧化微生物豐度的影響目前尚無定論。此外，鹽分在影響AOA 和AOB 豐度的同時也影響其群落結構的改變。前人研究表明，在不同鹽分環境中AOA 的群落結構會發生改變，AOB 的群落結構多樣性和鹽分梯度無相關關系[12]，而濕地土壤中鹽分可顯著改變AOA 和AOB 的群落結構[13]。有研究表明AOB 的多樣性會隨著鹽分的增加而提高[14]，但是Dang等[15]研究發現鹽分會降低AOB 的多樣性。鹽分是一個日益受到關注的環境因素，然而鹽分對土壤氨氧化微生物豐度和群落結構影響的認識仍然存在爭議。

新疆地處我國的西北部，屬于干旱地區，淡水資源短缺問題尤為嚴重。但是該地區咸水資源比較豐富，在淡水資源短缺不斷加劇的背景下，合理利用咸水資源進行灌溉已經成為農業生產中緩解淡水資源不足的較為經濟、有效的手段。咸水灌溉一方面提供了作物生長所需要的水分，緩解旱情；另一方面也將鹽分帶入土壤，改變土壤的理化性質，進而影響土壤養分轉化和微生物生長。AOA 和AOB 共同參與土壤硝化作用，然而，關于長期咸水灌溉對AOB和AOA群落結構的影響及其對土壤硝化作用的貢獻所知甚少。因此，了解土壤氨氧化微生物群落結構多樣性對咸水灌溉引起的土壤鹽分變化的響應具有重要意義。本研究在已連續開展10 年咸水滴灌試驗的基礎上，通過熒光定量PCR 方法測定AOA 和AOB 的豐度，采用高通量測序分析AOA和AOB群落結構多樣性。我們假設經過長期咸水滴灌會改變AOA和AOB的群落結構，降低AOA和AOB豐度并抑制硝化作用。因此，本研究的目的是比較不同灌溉水鹽度對氨氧化微生物豐度和群落結構的影響，評價AOA 和AOB 對于硝化作用的貢獻，并探討分析土壤理化性質與氨氧化微生物豐度和群落結構間的關系。

1 材料和方法

1.1 試驗區概況

試驗區位于石河子大學農學院試驗站（44°18′N，86°02′E）內，平均海拔450.8 m。試驗區屬于典型溫帶干旱大陸性氣候，多年平均氣溫為6.5～7.2 ℃，無霜期為168～171 d，年日照時數為2721～2818 h，年蒸發量1660 mm，年平均降水量為210 mm。試驗區土壤類型為石灰性沖積土。0～30 cm 土層基礎理化性質（2009年試驗開始前）如下：電導率（EC）為0.13 dS·m-1，pH 值7.9，速效磷25.9 mg·kg-1，速效鉀253 mg·kg-1，全氮1.1 g·kg-1，有機質16.8 g·kg-1。供試作物為棉花（Gossypium hirsutumL. cv Xinluzao No. 52），通常在4月中旬種植，9月中旬收獲。

1.2 試驗設計

試驗區在2009—2017 年已經連續開展9 年的不同鹽度灌溉水滴灌田間試驗。依據灌溉水鹽度設置了3 個處理，每個處理3 次重復，共9 個小區，每個試驗小區面積25 m2，采用完全隨機區組設計。3個處理的灌溉水鹽度分別為0.35、4.61、8.04 dS·m-1（分別用FW、BW 和SW 表示），試驗中FW 取自當地深層地下水，BW 和SW 處理灌溉水鹽分是通過在淡水中加入等量的NaCl 和CaCl2（質量比1∶1）配制而成。氮肥（尿素N≥46.4%）施用量為N360 kg·hm-2，此氮肥用量為當地棉花大田生產推薦用量。2018 年試驗開始前3種灌溉水鹽度處理土壤基本理化性見表1。

棉花種植采用覆膜栽培，一膜兩管4 行，行距配置為（30+60+30）cm，播種密度22.2 萬株·hm-2。2018年棉花于4 月20 日播種，為保證出苗，播種后滴淡水45 mm。棉花生長期間灌水9次，6月中旬開始至8月下旬結束，灌溉周期為7～10 d，每次灌水45～60 mm，總灌溉量450 mm，磷肥（重過磷酸鈣，P2O5≥44.0%）施用量為P2O5105 kg·hm-2，鉀肥（硫酸鉀，K2O≥51.0%）施用量K2O 60 kg·hm-2，全部作基肥在播種前一次性施入。試驗中氮肥全部作追肥，2018 年氮肥分別在6月27 日（第二水）、7 月4 日（第三水）、7 月12 日（第四水）、7 月19 日（第五水）和7 月25 日（第六水）通過滴灌系統分五次隨水施用。其他栽培管理措施參照當地大田生產。

1.3 土壤樣品采集與測定

2018 年（試驗第10 年）在棉花蕾鈴期，最后一次施肥結束后第3 d（7 月28 日）用直徑2.5 cm 土鉆在每個小區的棉花行內，按S 型線路隨機采集3 個耕層土壤樣品，采集深度為0～20 cm。每個小區3個重復，土樣混合均勻并去除其中的雜物、細根。將一部分土樣過2 mm 篩后分成兩部分，一部分用于測定土壤理化性質和土壤潛在硝化勢，一部分用于氨氧化微生物豐度和多樣性的檢測。用于提取DNA 的土壤樣品保存于-80 ℃條件下。

1.3.1 土壤理化性質和潛在硝化勢測定

土壤含水量采用烘干法測定；土壤鹽度和pH 值采用MP521 Lab pH/ Conductivity Meter 型電導率儀測定，測定鹽度水土比為5∶1[16]，測定pH 值水土比為2.5∶1[17]；土壤NO-3-N 和NH+4-N 使用2 mol·L-1KCl 浸提后使用流動分析儀測定（Smart Chem140，Analytik Jena AG）[18]；土壤有機碳（SOC）使用K2Cr2O7-H2SO4外加熱法測定[16]；土壤全氮（TN）使用半微量凱氏定氮法測定[16]。

表1 2018年試驗開始前3種灌溉水鹽度處理土壤理化性質Table 1 Physicochemical properties of the soils under three water salinity treatments prior to the beginning of the experiment in 2018

土壤潛在硝化勢測定采用Kurola 等[19]測定方法，準確稱取5 g 新鮮土壤樣品于50 mL 離心管中振蕩培養24 h后，使用2 mol·L-1KCl浸提并通過比色法測定土壤浸提液中的濃度，潛在硝化勢（PNR）以μg（）·g-1·h-（1干土）表征。

土壤潛在硝化勢計算公式如下：

式中：c為從標曲上查得的顯色液濃度，mg·mL-1；V為顯色液的體積，mL；ts為分取倍數，m為烘干樣品質量；24為24 h。

1.3.2 DNA提取

稱取新鮮土壤樣品0.3 g，使用Power SoilTMDNA Isolation Kit（Mo Blo Laboratories，Inc，USA）試劑盒，按照操作說明書提取DNA 樣品，并將提取的土壤總DNA在-80 ℃下保存。

1.3.3qPCR測定

使用實時熒光定量PCR 儀檢測目標基因豐度，qPCR 的 反 應 體 系 為20 μL，其 中 包 括10 μL 2×SYBR?GreenqPCR Master Mix（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA），前后引物各1 μL，2 μL DNA 模板（約2 ng·μL-1）和6 μL ddH2O。AOAamoA基因擴增 引 物 是Arch-amoAF（5′ - STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′）和Arch-amoAR（5′ -GCGGCCATCCATC TGTATGT-3′）[20]。AOBamoA基因擴增引物是amoA-1F（5-GGGG TTTCTACTGGTGGT）和amoA-2R（5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′）[21]。PCR 反應體系如下：95 ℃5 min，接著40 個循環，95 ℃10 s，55 ℃20 s，72 ℃30 s。

1.3.4 高通量測序

采用高通量測序技術測定AOA和AOB群落結構組成。PCR擴增引物與qPCR相同。PCR擴增體系為25 μL，其中包括2 μL DNA 模板，前后引物各1 μL，5 μL 5×PCR buffer，2 μL（2.5 mmol·L-1）dNTP，5 μL 5×Q5High GC Enhancer buffer，0.25 μL（0.02U·μL-1）Q5 High - Fidelity DNA polymerase（NEB）和8.75 μL ddH2O。反應體系如下：98 ℃5 min，接著35 個循環，98 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，最后72 ℃5 min。PCR 產 物 使 用Agencourt AMPure Beads（Beckman Coulter，Indianapolis，IN）純化，并用PicoGreen dsDNA Assay kits（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）質量化，各樣品等量混合后，在上海派森諾生物科技股份有限公司（上海，中國）使用Illumina MiSeq 平臺進行高通量測序，每個處理重復3次。

1.4 數據分析

使用SPSS 軟件（Version SPSS 21.0）進行數據方差分析和相關性分析，顯著水平為0.05；各處理間差異比較采用LSD 法（P＜0.05）；高通量測序結果使用UCHIME 軟件（Version 4.2），鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數據。使用QIIME 軟件（Version 1.8.0）對序列在97%的相似度水平下進行聚類并獲得OTUs數，基于OTUs數得到不同分類水平上的物種豐度，再利用R 語言（Version 3.2.0）繪制成樣品各分類學水平下的群落結構圖。使用Mothur（Version 1.30.1）軟件分析樣品α 多樣性指數（ACE，Chao1，辛普森指數，香農指數），分析時將樣品所含序列數進行標準化并在97%相似度水平下，對各樣品α 多樣性指數值統計。基于Galaxy 平臺進行LEfSe 分析[Line discriminant analysis（LDA）Effect Size]，LDA 值＞4。RDA 分析（Redundancy analysis）使用R 語言Vegan 包進行分析和作圖。

2 結果分析

2.1 咸水滴灌對土壤理化性質的影響

灌溉水鹽度顯著影響土壤理化性質（表2）。與FW處理相比，BW 和SW 處理土壤鹽分、含水量和含量顯著增加，而pH 值、SOC、TN含量顯著降低（P＜0.05，下同）。BW 和SW 處理含量較FW 處理降低13.5%和30.8%。相反，BW 和SW 處理含量較FW處理增加10.4%和15.2%。

表2 不同灌溉水鹽度處理土壤理化性質Table 2 Soil physicochemical properties as affected by different irrigation water salinity treatments

2.2 咸水滴灌對土壤潛在硝化勢的影響

BW 和SW 處理顯著降低土壤潛在硝化勢（PNR）見圖1，FW 處理PNR 分別較BW 和SW 處理高18.1%和37.3%。

圖1 不同灌溉水鹽度處理土壤潛在硝化勢Figure 1 Soil potential nitrification rate as affected by different irrigation water salinity treatments

2.3 AOA和AOB豐度及對土壤潛在硝化勢的相對貢獻

BW 和SW 處理顯著降低土壤AOA 和AOB 豐度（表3）。不同處理土壤AOAamoA基因豐度在2.18×106～3.57×106copies·g-1（干土），AOBamoA基因豐度在1.94×105～3.15×105copies·g-1（干土）。與FW 處理相比，BW 和SW 處理AOA 和AOB 豐度分別較FW 處理 降 低28.4%、39.0% 和23.3%、38.4%。BW 處 理AOA/AOB顯著低于FW和SW處理，而SW和FW處理之間無顯著差異。

AOA 和AOB 對PNR 的相對貢獻如圖2 所示。AOA豐度與PNR呈極顯著正相關關系（R2=0.922 8，P＜0.001）。相似地，AOB豐度也與PNR呈極顯著正相關關系（R2=0.948 9，P＜0.001）。說明PNR 的變化與AOA和AOB豐度存在高度的相關性。

2.4 AOA和AOB α多樣性

各處理AOA 和AOB 的amoA基因的測序數在79 812～80 076（表4），覆蓋度在0.997 1～0.999 7。在97%的相似度水平下，AOA 和AOB 序列分別可劃分為661～664 和130～140 OTUs。BW 和SW 處理顯著降低AOB 群落OTUs，但對AOA 無影響。ACE 和Chao1指數通常用來衡量群落中含OTU 數目的指數，ACE和Chao1 指數越大，表明群落的豐富度越高。辛普森和香農指數用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響，一般香農指數值越大，辛普森指數值越小，說明樣品的物種多樣性越高。灌溉水鹽度對豐富度指數（ACE 和Chao1）無顯著影響。與FW 處理相比，BW 和SW 處理顯著增加AOA 香農指數，且辛普森指數顯著降低。SW 處理顯著降低AOB 香農指數，且顯著增加辛普森指數。BW 處理對AOB多樣性指數無顯著影響。

表3 不同灌溉水鹽度處理AOA和AOB豐度Table 3 Abundance of AOA and AOB as affected by different irrigation water salinity treatments

圖2 AOA（a）和AOB（a）豐度與土壤潛在硝化勢的相關性Figure 2 Correlations between AOA（a）and AOB（b）abundance and potential nitrification rate of soil

2.5 土壤理化性質與AOA、AOB的豐度、多樣性指數、潛在硝化勢之間相關性分析

土壤理化性質與AOA、AOB 的豐度，多樣性指數，土壤潛在硝化勢之間相關關系見表5。土壤潛在硝化勢，AOA、AOB 豐度，AOA 群落辛普森指數與pH、、SOC、TN呈顯著正相關，但是和EC、SWC、呈顯著負相關。AOA的香農指數與EC、SWC、呈顯著正相關，而與pH、SOC、TN 呈顯著負相關。AOB的辛普森指數與EC、SWC、呈顯著正相關，而與、SOC、TN 呈顯著負相關。AOB 的香農指數與、SOC、TN 呈顯著正相關，而僅與EC呈顯著負相關。

表4 不同灌溉水鹽度處理AOA和AOB α多樣性Table 4 α diversity properties of AOA and AOB as affected by different irrigation water salinity treatments

表5 土壤理化性質與潛在硝化勢，AOA、AOB豐度，多樣性指數間相關性分析Table 5 Correlations among soil physicochemical properties，potential nitrification rates，AOA and AOB abundance and diversity under different water salinity treatments

2.6 AOA和AOB群落結構

高通量測序結果顯示，綱水平上，AOA 群落由CandidatusNitrosocaldus、CandidatusNitrososphaera、Betaproteobacteria、Marine archaeal group 1、Unknown組成（圖3a）。除Unknown，CandidatusNitrosocaldus（0.6%～1%）相對豐度較高。CandidatusNitrosocaldus屬于自養和需氧氨氧化古菌，常出現在中性或微堿性陸地地熱環境中。不同灌溉水鹽度對AOA 群落影響不一致，例如，Betaproteobacteria 和Marine archaeal group 1對灌溉水鹽度較為敏感，BW 和SW 處理中Betaproteobacteria 相對豐度顯著低于FW 處理，而Marine archaeal group 1 顯著高于FW 處理；SW 處理CandidatusNitrosocaldus顯著高于FW和BW處理。

AOB 屬水平上群落主要由Nitrosospira、Nitrosomonas、Nitrosovibrio和Unknown 組成（圖3b），Nitrosospira（52.9%～59.4%）相對豐度較高。Nitrosospira屬于氨氧化細菌中的一類，參與氨氧化過程對亞硝酸鹽的親和力較高，可高效利用底物。Nitrosomonas隨著灌溉水鹽度的增加相對豐度顯著降低，SW 處理中沒有檢測到Nitrosomonas的存在。BW 處理中Nitrosospira相對豐度顯著低于FW和SW處理。

2.7 AOA和AOB群落LEf Se分析

使用LEfSe（LDA＞4.0，P＜0.05）進行不同處理間群落比較分析，得到不同灌溉水鹽度條件下氨氧化微生物群落顯著差異種群（圖4）。AOA僅有1個差異物種（圖4a），出現在SW 處理，說明AOA種群相對穩定，高鹽度灌溉水刺激CandidatusNitrosocaldus 生長，AOB 共有5 個顯著差異物種（圖4b），5 個差異種群均來自BW 處理，說明中等鹽度灌溉水可刺激Bacteria，Proteobacteria、Nitrosomonadaceae、Betaproteobacteria、Nitrosomonadales的生長。

2.8 AOA、AOB與土壤理化性質間RDA分析

利用RDA 分析AOA 和AOB 群落結構與土壤理化性質的關系，AOA 群落結構與土壤理化性質間的關系見圖5a，軸1 的解釋度為54.8%，軸2 的解釋度為26.9%。AOA 群落結構與（解釋度59.1%，P=0.002）、pH 值（解釋度23.2%，P=0.032）、土壤鹽分（解釋度10.4%，P=0.042）存在顯著相關關系。對于AOB，軸1 解釋度為57.5%，軸2 解釋度為31.2%（圖5b）。AOB 群落結構僅與（解釋度33.3%，P=0.04）、pH 值（解釋度47.7%，P=0.012）呈顯著相關關系，與其他土壤理化性質無顯著相關關系。

圖3 不同灌溉水鹽度處理氨氧化微生物群落結構Figure 3 Community structure of AOA and AOB as affected by different irrigation water salinity treatments

圖4 不同灌溉水鹽度處理AOA（a）和AOB（b）群落LEfSe分析Figure 4 LEfSe analysis of AOA（a）and AOB（b）communities under different irrigation water salinity treatments

3 討論

3.1 咸水滴灌對土壤理化性質的影響

淡水資源短缺是限制農業可持續發展的重要因素，合理利用咸水灌溉已成為緩解干旱區淡水資源不足的重要手段。然而，長期咸水灌溉會導致鹽分在土壤中的積累，影響土壤理化性質和養分的循環轉化，特別是氮素轉化的關鍵過程[22]。本研究結果表明微咸水、咸水灌溉使土壤鹽分、含水量、含量顯著增加，而pH 值、有機質、含量顯著降低。土壤含水量增加是因為鹽水灌溉土壤蒸散率降低[23]。pH值降低可能是因為土壤中氯離子的積累，導致土壤pH 值下降[24]。有機質的降低是因為鹽漬土壤中植物生物量減少導致有機物輸入量下降[25]。另外，微咸水、咸水處理，土壤含量增加，而含量呈現相反的趨勢，可能是土壤鹽度的增加抑制了土壤的硝化作用[26]。

3.2 咸水滴灌對土壤潛在硝化勢和AOA、AOB豐度的影響

土壤潛在硝化勢可直接反映土壤硝化活性。本研究結果表明長期微咸水和咸水灌溉顯著抑制土壤潛在硝化勢。這與He 等[27]研究相似，其研究結果顯示土壤潛在硝化勢隨土壤鹽度的增加而顯著降低。然而，也有研究表明適度鹽分可提高土壤潛在硝化速率，而高鹽度抑制土壤潛在硝化速率[28]，這可能是因為一些參與硝化作用的微生物具有一定的耐鹽性，在一定鹽度范圍內可促進硝化作用微生物的生長，提高硝化速率[29]。

AOA 和AOB 是參與硝化作用的關鍵微生物，鹽分是影響其生長的重要因素[30]，本研究發現隨著灌溉水鹽度的增加，AOA 和AOB 豐度均顯著降低。Jin等[31]研究也發現，較高的鹽分會抑制AOB生長。然而也有研究發現鹽分對AOA 豐度無顯著影響[32]，或者中等鹽度可以刺激AOA 生長[33]。前人研究表明新疆堿性土壤中AOB 豐度高于AOA，是主導微生物類型[34]。但本研究表明AOA 豐度高于AOB，可能是微咸水和咸水灌溉后土壤鹽分成為影響AOA、AOB 生長和活性的主導因素。Bernhard 等[35]也得到相似的研究結果。但也有研究發現河口區AOB 豐度高于AOA[36]，甚至鹽分越高AOB 豐度高于AOA 的幅度越大[37]。這些矛盾的結果可能是AOA 和AOB 屬于兩類微生物群體，不同環境條件下，AOA 和AOB 對于鹽分的響應是不同的。另外自然環境復雜多變，可能是多種因素綜合作用下共同影響AOA和AOB活性[38]。

圖5 AOA（a）和AOB（b）群落結構與土壤理化性質間RDA分析Figure 5 Redundancy analysis（RDA）of correlations between soil physicochemical properties and the community structure of AOA（a）and AOB（b）

3.3 咸水滴灌對土壤AOA 和AOB 群落組成及多樣性的影響

咸水、微咸水灌溉改變了AOA 和AOB 的群落結構。本研究表明AOA 群落多樣性高于AOB，在含有鹽分的河口區和海岸區環境中也出現相似的結果[27，39]。不同灌溉水鹽度對AOA 和AOB 群落多樣性的影響是不一致的。對于AOA 來說，隨著灌溉水鹽度的增加，群落辛普森指數顯著降低，而香農指數顯著增加。而對于AOB 來說，咸水灌溉顯著增加AOB群落辛普森指數，而降低香農指數。說明，在該環境條件下AOA 群落結構對于鹽分的變化更為敏感。Gao 等[40]研究也表明鹽分越高AOA 多樣性越高，而AOB 群落多樣性在中等鹽度時最高，在高鹽度時最低。也有研究發現在紅樹林沉積物中鹽分與AOB 群落香農指數呈正相關關系，與辛普森指數呈負相關關系，而AOA 群落多樣性對鹽分變化不敏感[41]。說明不同土壤環境下鹽分對AOA和AOB的群落結構影響存在差異。

雖然灌溉水鹽度對AOA 群落OTUs 無顯著影響，但是AOA 群落對于不同灌溉水鹽度的響應是不同的。通常AOA 的耐受性較強，對環境的改變不敏感[42]。本研究結果表明在綱水平上，除Unknown 外，CandidatusNitrosocaldus 是主要微生物種群，咸水灌溉顯著增加CandidatusNitrosocaldus 相對豐度，說明其對鹽分具有較強的耐受性。另外也有可能是CandidatusNitrosocaldus 一些物種可將尿素直接作為生長的能量來源[43]，因此獲得能量來源的途徑較多，利于其完成整個硝化作用。本研究中隨著灌溉水鹽度的增加Marine archaeal group 1 相對豐度顯著增加，說明鹽分激發了AOA 耐鹽種群的生長。原因可能是Marine archaeal group 1 主要在海洋環境中出現，對于鹽分具有較好的適應性[44]。在AOB 屬水平上，Nitrosospira是優勢微生物種群，且咸水灌溉Nitrosospira相對豐度高于微咸水灌溉。另外，Nitrosomonas相對豐度隨著灌溉水鹽度的增加而顯著降低，SW 處理中沒有檢測到Nitrosomonas的存在。這與前人研究一致，即Nitrosospira在高鹽環境富集，而Nitrosomonas在低鹽或者中鹽環境中富集[45]。

LEfSe分析結果表明AOA 群落結構較為穩定，只有咸水灌溉時刺激了CandidatusNitrosocaldus 生長。而AOB 群落對于鹽分的響應較為敏感，微咸水灌溉出現5 個顯著高于其他處理的差異物種，這再一次印證了我們推測的微咸水灌溉條件下AOB 較為活躍，是參與硝化作用的主導微生物種群，而咸水灌溉條件下AOA可能是主導微生物種群。

3.4 土壤性質對AOA和AOB群落結構的影響

咸水灌溉抑制氨氧化微生物的生長，改變其群落結構，然而土壤的環境條件復雜，AOA 和AOB 對潛在硝化作用的貢獻高度依賴于土壤初始環境[46]，經過10年咸水灌溉，土壤理化性質發生顯著改變，環境因素的改變也影響著氨氧化微生物群落的變化。RDA 結果表明，除鹽分以外解釋AOA 群落結構總變異量的59.1%（P=0.002），解釋AOB 群落總變異的33.3%（P=0.04），說明咸水、微咸水灌溉條件下是影響AOA和AOB群落結構的主要因素之一。但是也有研究表明，土壤僅與AOB 群落變化存在顯著相關關系[47]。這可能是由于土壤養分條件不同，長期咸水灌溉土壤氮素水平顯著低于淡水灌溉，AOA一般在較苛刻的環境（低氮、強酸性和高溫）中生長更為活躍，表達功能活性更強[48]。此外，土壤pH 是影響AOA 和AOB 群落變化的主要因素，pH 對AOB 群落（解釋度47.7%，P=0.012）的影響要大于AOA（解釋度23.2%，P=0.032）。這可能是因為AOA 細胞具滲透膜，可維持細胞內pH 接近中性[49]，而本研究中pH 變化范圍較小，AOB 群落對于pH 變化響應比AOA 更敏感。然而，有學者研究表明一般堿性土壤中硝化作用主導微生物類型是AOB，而與AOA 關系不大[50]。不一致的結果說明鹽分是影響農田土壤氨氧化微生物生態位變化的主導因素。然而本試驗還不能具體分析出AOA 和AOB 分別對硝化作用的貢獻率，這仍然需要后續進行深入研究。

4 結論