血清IL-6、IL-10、IL-17及IL-33水平與食管癌患者放射性肺損傷關系的研究

陳安艷，王連青，申振濤，閆琳

聊城市傳染病醫院腫瘤科，山東 聊城 252000

放射性肺損傷（radiation induced lung injury，RILI）是臨床常見的胸部腫瘤放射治療后的并發癥和最主要的劑量限制性不良反應[1]。近年來放療技術不斷發展，尤其是三維適形放療和調強放療大大延長了食管癌患者的生存期，但是放療對肺部正常組織造成的損傷仍然是影響患者預后和生活質量的主要危險因素[2]。而聯合使用化療藥物更是在某種意義上增加了RILI的發生率[3]。尋找關鍵的生物效應分子，及早預測并判斷RILI對肺癌患者的風險分層和個體化治療具有重要的臨床價值?；诮陙碛嘘PRILI機制的深入研究，普遍認為炎癥反應是造成肺損傷的主要原因。由肺泡上皮細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等分泌的一系列細胞因子及趨化因子相互作用，可啟動并維持“瀑布樣”炎癥反應，從而引發RILI，促進膠原纖維大量產生，最終進展為肺纖維化[4]。本研究采用三維適形放療或調強放療治療局部晚期食管癌患者，分析放療前后患者的血清白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、IL-17及IL-33水平，并結合患者的臨床特征，分析食管癌患者發生RILI的影響因素，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016年1月至2017年11月于聊城市傳染病醫院就診的局部晚期食管鱗狀細胞癌患者117例。納入標準：①經病理學檢查確診為食管鱗狀細胞癌；②首次確診，TNM分期為Ⅲb～Ⅳ期；③初次接受放射治療；④不可手術或拒絕手術并自愿接受胸部放療；⑤預計生存時間＞6個月；⑥卡氏功能狀態（Karnofsky performance status，KPS）評分＞70分。排除標準：①既往接觸過放射性物質者；②入院前6個月有胸部手術史者；③合并嚴重肺氣腫、消化道炎癥、肺心病、肺功能不全、心肌梗死、糖尿病者。117例患者中，男70例，女47例；年齡為27～82歲，平均年齡為（59.58±13.98）歲。根據放療后是否發生2級及以上RILI將患者分為RILI組和非RILI組。本研究經醫院倫理委員會審核通過，所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 治療方案

制訂放療計劃：采用西門子Somatom Spirit CT模擬定位機及醫科達IMPAC放射治療網絡系統進行胸部計算機體層攝影（CT）模擬定位增強掃描，圖像經放射治療網絡數字化傳輸，采用醫科達核通Oncentra治療計劃系統進行三維重建。由放療中心兩位副主任醫師勾畫腫瘤靶區體積（gross target volume，GTV）、臨床靶區體積（clinical target volume，CTV）和計劃靶區體積（planning target volume，GTV），所有患者均接受6-MV X線照射，常規分割劑量為每次1.8～2.0 Gy共23次或2.0 Gy×20次后行大孔徑CT復位。采用5～9野共面照射技術，危及器官的劑量限制：全肺V20＜26%；脊髓受量＜45 Gy；心臟Dmean＜35 Gy，V40＜30%，V30＜40%。所有患者接受放療的總劑量為50～60 Gy，5～6周完成治療。其中74例患者于放療前或放療后3個周期接受以鉑類化合物為基礎的化療方案，順鉑25 mg/m2，d1～3，21天為1個周期。

1.3 觀察指標及檢測方法

分析患者放療前后的外周血IL-6、IL-10、IL-17、IL-33水平。分別于放療前、放射劑量達到20 Gy、放射劑量達到40 Gy、放療結束時以及放療開始后第12、24、28周采集患者的外周靜脈血，為了確保結果的一致性，盡量將采血時間控制在7:00-9:00 am。將采集的血液置于真空采血管中，室溫靜置15 min，3000 r/min離心15 min，離心半徑為8 cm。取上清，置于-70℃冰箱中保存備用。采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）進行檢測，按照試劑盒說明書進行操作。試劑盒購自武漢基因美生物科技有限公司，全自動酶免分析儀購自美國BIO-RAD公司。

1.4 隨訪方法及評價標準

患者出院后前3個月，每個月復查1次；出院后3～12個月，每3個月復查1次；出院1年后，每6個月復查1次。復查項目包括體檢及血常規、肝功能、胸部CT檢查等。隨訪截止時間為2018年9月。由2名專業醫師根據胸部CT檢查結果以及臨床指征，按照美國放射腫瘤學協作組（Radiation Therapy Oncology Group，RTOG）制定的標準[6]診斷RILI。RILI的影像學診斷標準：①有胸部放療史；②在X線片或CT片上出現與放射野基本一致的肺部病變，可見斑片狀、片狀密度增高的模糊陰影，CT片可見磨玻璃狀或云霧狀陰影，典型者呈“直的邊緣效應”或“十字征”，可伴有胸膜反應或少量胸腔積液；③肺部病變在抗生素治療1周后不消失或將永久性存在。診斷RILI時需排除肺內感染及肺內病變進展，且相關癥狀分級至少較放療前增加1級。評價終點為2級及以上RILI。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Logisitc回歸模型分析食管癌患者發生RILI的影響因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RILI 的發生情況

117例患者隨訪2～13.5個月，中位隨訪時間為6.7個月。20例（17.09%）患者在放療結束后6個月內發生2級及以上RILI，其中2級RILI 16例，3級RILI 4例，無4級和5級RILI。

2.2 兩組患者臨床特征的比較

RILI組患者20例，非RILI組患者97例。RILI組患者的年齡為（64.80±11.25）歲，高于非RILI組的（57.11±13.69）歲，差異有統計學意義（t=2.351，P＜0.05）。RILI組和非RILI組患者的性別、化療情況、既往肺功能狀態比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；RILI組和非RILI組患者的吸煙情況、KPS評分、臨床分期、放射劑量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組患者臨床特征的比較

2.3 血清IL-6、IL-10、IL-17、IL-33水平的比較

放療前，RILI組和非RILI組患者的血清IL-6、IL-10、IL-17、IL-33水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。隨著放射劑量增加和時間推移，非RILI組患者的血清IL-6、IL-10、IL-17、IL-33水平均無明顯變化。RILI組患者放射劑量達到40 Gy時，血清IL-6水平出現一個小高峰，放療結束后，RILI組患者的血清IL-6水平逐漸上升，放療開始后第12周時血清IL-6水平達到峰值，隨后逐漸降低；放射劑量達到40 Gy、放療結束時以及放療開始后第12、24周時，RILI組患者的血清IL-6水平均高于非RILI組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。隨著放射劑量增加和時間推移，RILI組患者的血清IL-10水平無明顯變化；放射劑量達到20 Gy時、放射劑量達到40 Gy時、放療結束時以及放療開始后第12、24、28周時，兩組患者的血清IL-10水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。從放射劑量達到40 Gy起，隨著放射劑量增加和時間推移，RILI組患者的血清IL-17水平逐漸升高，至放療開始后第24周時達到峰值；放療結束時以及放療開始后第12、24、28周時，RILI組患者的血清IL-17水平均高于非RILI組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。從放射劑量達到40 Gy起，隨著放射劑量增加和時間推移，RILI組患者的血清IL-33水平逐漸升高，放療開始后第12周時達到峰值，隨后逐漸降低；放療結束時以及放療開始后第12、24、28周時，RILI組患者的血清IL-33水平均高于非RILI組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同時間點兩組患者血清IL-6、IL-10、IL-17、IL-33水平的比較（pg/ml，±s）

表2 不同時間點兩組患者血清IL-6、IL-10、IL-17、IL-33水平的比較（pg/ml，±s）

注：*與同時間點非RILI組比較，P＜0.05

指標IL-6 IL-10 IL-17 IL-33時間放療前放射劑量達到20 Gy放射劑量達到40 Gy放療結束時放療開始后第12周放療開始后第24周放療開始后第28周放療前放射劑量達到20 Gy放射劑量達到40 Gy放療結束時放療開始后第12周放療開始后第24周放療開始后第28周放療前放射劑量達到20 Gy放射劑量達到40 Gy放療結束時放療開始后第12周放療開始后第24周放療開始后第28周放療前放射劑量達到20 Gy放射劑量達到40 Gy放療結束時放療開始后第12周放療開始后第24周放療開始后第28周RILI組（n=20）67.85±17.35 76.51±15.82 106.32±23.18*89.16±16.48*134.65±22.87*123.60±21.42*85.03±17.69 9.25±3.13 8.96±2.85 10.04±2.98 9.83±3.10 11.14±3.39 10.68±3.21 10.26±3.30 79.51±18.76 81.55±20.73 93.42±21.56 128.67±28.45*138.90±25.82*142.78±30.04*134.23±24.95*497.81±66.94 510.75±72.36 563.82±95.78 647.15±91.60*758.68±110.75*659.67±96.32*587.44±85.35*非RILI組（n=97）74.31±14.22 71.80±12.79 74.57±17.62 72.33±15.89 79.84±18.79 72.57±15.94 79.42±14.85 9.91±3.42 8.98±3.11 9.95±2.78 10.49±3.25 10.80±2.97 9.93±3.28 9.75±2.91 83.14±21.20 83.98±21.89 95.79±24.81 94.38±24.69 93.11±21.30 89.85±26.42 87.46±19.87 500.02±79.83 517.88±84.20 512.56±81.49 489.23±86.72 502.34±87.13 510.78±80.69 487.26±75.63

2.4 血清IL-6、IL-10、IL-17、IL-33水平變化情況的比較

放療期間，RILI組中IL-6、IL-17、IL-33升高的患者比例均高于非RILI組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；RILI組和非RILI組中IL-10升高的患者比例比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表3）

表3 兩組患者放療期間血清IL-6、IL-10、IL-17、IL-33水平變化情況的比較

2.5 食管癌患者發生RILI影響因素的Logistic多因素分析

Logistic多因素逐步回歸分析結果顯示，年齡、化療、既往肺功能異常及血清IL-6、IL-17、IL-33水平升高均是食管癌患者發生RILI的獨立危險因素（P＜0.05）。（表4）

表4 食管癌患者發生RILI影響因素的Logistic多因素分析（n=117）

3 討論

中國屬于食管癌的高發地區，對于局部晚期食管癌患者多采取以放化療為主的綜合治療方案。但是不同患者即使臨床特征類似、放射劑量和放療方案相同，其發生RILI的風險也不甚相同[7]。近幾年，隨著三維適形放療和調強放療技術的發展，雖然食管癌的局部控制率及患者的生存率均獲得一定程度的改善，因放化療造成的腫瘤周圍正常組織損傷的風險已經大大降低，但RILI仍然是影響患者預后和生活質量最重要的危險因素之一。臨床上制訂放療方案的原則是在確保正常組織輻射耐受的前提下，盡可能提高對腫瘤組織的輻射劑量。然而在目前循證醫學治療模式下，所有的食管癌患者仍然是按群體的最佳數據給予放射治療，因此探索RILI的影響因素對于個體化治療具有十分重要的臨床價值。

本研究共納入117例局部晚期食管鱗狀細胞癌患者，進行根治性三維適形放療或調強放療，根據V20、V30等經典物理學參數評估放療計劃，但是仍有20例患者放療開始后6個月內發生2級及以上RILI，其發生率為17.09%，與相關文獻報道的數據基本一致[8]。說明經典物理學參數并不能完全預測RILI的發生。目前，很多研究證實多種細胞因子或趨化因子與RILI的發生密切相關，有望成為預測或動態監測RILI發生的重要指標。王忠明等[9]研究表明，血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）及T淋巴細胞亞群水平與放射性肺病具有一定的相關性。鄭芳芳等[10]研究發現，放療前IL-8水平較低的肺癌患者及放療20 Gy時TGF-β1水平升高的肺癌患者，RILI的發生風險較高。除此以外，鮮有相關研究探討其他細胞因子與RILI的關系。IL-6、IL-10、IL-17和IL-33均屬于典型的炎癥誘導或抑制因子，一直是各型炎癥以及免疫紊亂等疾病研究的熱點之一[11]。IL-6是炎癥急性期合成的一種重要的非特異性炎癥因子，可通過激活核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）、SMAD和絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）等多條途徑活化相關炎癥細胞，促進細胞外基質沉積和膠原纖維生成，參與肺部炎癥甚至纖維化的病理過程[12]。本研究中，隨著放射劑量增加和時間推移，RILI組患者的血清IL-6水平出現波動，先升高后回落，隨后又再次升至峰值后回落，推測可能由于放射線造成肺組織損傷后引起炎癥反應，導致IL-6合成迅速增加，而隨著機體免疫系統對炎癥反應的自我調控作用以及炎癥的逐漸消退，IL-6水平呈回落趨勢。由于RILI組患者已經出現放射性損傷，并不能完全自我修復，引起各種炎癥細胞募集，并促使IL-6進一步分泌，進一步造成炎癥因子的“級聯瀑布反應”，最終加劇了RILI。IL-10主要是由調節性T細胞產生的一類干擾素家族成員之一，屬于抗炎因子。IL-17則是由輔助性T細胞（helper T cell，Th）產生的一類細胞因子，通過與IL-17受體結合，促使趨化因子的表達，進而增加集落刺激因子的大量分泌，從而招募多種炎癥細胞，引起RILI的發生。尤其在炎癥或感染早期，IL-17可通過有效介導中性粒細胞參與促炎癥反應，屬于早期炎癥反應的預測因子[13]。目前IL-17與RILI發生關系的研究并不多見。IL-33是表達于肺泡上皮細胞及內皮細胞表面的一類細胞因子，通過與其受體ST2結合誘導Th2細胞活化，參與多種免疫炎癥性疾病的發生?；谏鲜隼碚摲治觯狙芯糠治鍪彻馨┗颊咧蠭L-6、IL-10、IL-17及IL-33四種細胞因子與RILI的關系，結果顯示，隨著放射劑量增加和時間推移，RILI組患者的血清IL-6、IL-17和IL-33水平均呈升高趨勢，從放療結束開始，RILI組患者的血清IL-17和IL-33水平均高于非RILI組患者，而IL-6水平則出現一定程度的波動，但是整體水平一直高于非RILI組患者，但是并未發現RILI組患者血清IL-10水平出現明顯波動。說明IL-10與RILI的關系可能不大，與Arpin等[14]的研究結果基本一致。動物實驗證實，博來霉素誘發小鼠肺組織急性損傷后，在小鼠的肺組織中也觀察到了類似于人類RILI的急性炎癥期及慢性纖維化期的肺損傷過程，在此過程中，小鼠血清中維持高水平的IL-33，提示IL-33可能參與了肺組織損傷后的病理生理進程[15]。本研究結果證實了放療期間IL-33水平升高可作為RILI早期的預測因子。對于放療期間IL-6、IL-17、IL-33等炎癥因子異常升高，但尚未表現出典型的RILI臨床癥狀的患者，需進一步結合影像學檢查判斷RILI的程度，并調整治療方案，減少肺野受累劑量，并給予阿米福汀等預防性藥物。同時放療過程中盡量避免感冒或其他口腔、呼吸道感染，做好防護工作，以降低RILI的發生率。本研究結果還顯示，年齡、化療、既往肺功能異常及血清IL-6、IL-17、IL-33水平升高均是食管癌患者發生RILI的獨立危險因素（P＜0.05）。然而本研究納入的樣本量較少，結果可能存在一定的偏差，需加大樣本量進一步研究。

綜上所述，RILI是一個涉及多階段、多因素、復雜的動態過程，需綜合考慮各種因素的影響，準確評估肺癌患者發生RILI的危險因素，以實現個體化治療。對于高齡、聯合化療、既往肺功能異常以及放療期間IL-6、IL-17、IL-33水平升高的局部晚期食管癌患者，必須監測肺功能指標，以指導臨床調整放療計劃。