lncRNA ATB 在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及對預(yù)后的影響

徐赟，郭錳，張成輝

南陽市中心醫(yī)院腫瘤科，河南 南陽 473000

食管癌為消化道惡性腫瘤，在中國發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，病死率居第4位[1]。食管鱗狀細(xì)胞癌為食管癌的常見亞型，多數(shù)的食管鱗狀細(xì)胞癌患者發(fā)現(xiàn)時已出現(xiàn)晚期轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致5年生存率極低[2-3]。因此若能及早了解患者預(yù)后情況，給予針對性的干預(yù)對降低死亡事件的發(fā)生具有重要意義。但目前缺少靈敏度、準(zhǔn)確度均較高的生物學(xué)標(biāo)志物評估預(yù)后情況。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一組長度大于200 bp的RNA，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[4-6]。被轉(zhuǎn)化生長因子β活化長鏈非編碼RNA（long non coding RNA activated by transforming growth factor-β，LncRNA ATB）為lncRNA家族的一員，有報(bào)道指出，其在乳腺癌及結(jié)直腸癌中表達(dá)異常，并與患者預(yù)后關(guān)系密切[7-8]。但lncRNA ATB在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及是否與患者預(yù)后存在聯(lián)系未見報(bào)道。因此本研究采用實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測食管鱗狀細(xì)胞癌患者中l(wèi)ncRNA ATB的相對表達(dá)量，分析其與患者預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床評估食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012年1月至2016年1月南陽市中心醫(yī)院收治的95例食管鱗狀細(xì)胞癌患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理活檢確診為食管鱗狀細(xì)胞癌；②均行手術(shù)切除；③均為初治，無家族遺傳史；④預(yù)期生存時間≥5個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前接受放化療等及其他針對性治療；②合并其他部位惡性腫瘤；③合并嚴(yán)重心肝腎功能不全；④術(shù)前合并感染性疾病；⑤存在手術(shù)禁忌證；⑥對治療藥物存在過敏反應(yīng)；⑦伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑧隨訪失聯(lián)。95例食管鱗狀細(xì)胞癌患者中男性67例，女性28例；平均年齡（63.72±7.04）歲；體重指數(shù)（22.04±3.42）kg/m2。取95例食管鱗狀細(xì)胞癌患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁組織（距腫瘤＞1 cm）進(jìn)行研究。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且所有患者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

采用qRT-PCR法檢測食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ATB的相對表達(dá)量，采用Trizol試劑提取食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁細(xì)胞中的總RNA，在20 μl體系中加入2 μg總RNA合成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行qRTPCR，以cDNA為模板，引物濃度為0.4 μmol/L，在15 μl體系中進(jìn)行擴(kuò)增。lncRNA ATB引物序列，上游：5'-TCTGGCTGAGGCTGGTTGAC-3'，下游：5'-ATCTCTGGGTGCTGGTGAAGG-3'。以GAPDH為內(nèi)參，上游：5'-GCAAGAGCACAAGAGGAAGA-3'，下游：5'-ACTGTGAGGAGGGGAGATTC-3'。PCR擴(kuò)增參數(shù)：95℃ 10 min預(yù)變性；95℃ 15 s，70℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt表示lncRNA ATB的相對表達(dá)量。

1.3 隨訪

采用電話或門診的方式對患者進(jìn)行隨訪，每月隨訪1次，隨訪時間為5～36個月，起始時間為2012年1月15日，截止時間為2019年1月20日。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，配對資料采用配對t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析lncRNA ATB評估患者預(yù)后的效能。采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)比較生存情況。影響因素的分析采用Cox單因素及多因素回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA ATB 相對表達(dá)量的比較

食管鱗狀細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ATB相對表達(dá)量為（9.23±2.50），明顯高于癌旁組織的（6.53±2.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.837，P＜0.01）。

2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌患者的生存情況及l(fā)ncRNA ATB 相對表達(dá)量

食管鱗狀細(xì)胞癌患者1年、2年、3年生存率分別為90.53%（86/95）、74.74%（71/95）、68.42%（65/95）。通過為期3年的隨訪，食管鱗狀細(xì)胞癌死亡患者lncRNA ATB相對表達(dá)量為（9.94±2.72），明顯高于生存患者的（7.69±2.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.025，P＜0.01）。

2.3 lncRNA ATB 相對表達(dá)量評估食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的效能

lncRNA ATB相對表達(dá)量評估食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的曲線下面積（area under curve，AUC）、靈敏度、特異度、約登指數(shù)及最佳截?cái)嘀捣謩e為0.853（95%CI：0.765～0.917）、75.00% 、87.30% 、0.623、9.34。（圖1）

圖1 lncRNAATB 相對表達(dá)量評估食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的ROC曲線

2.4 不同臨床特征的食管鱗狀細(xì)胞癌患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ATB表達(dá)情況的比較

以lncRNA ATB評估食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的最佳截?cái)嘀?.34作為臨界點(diǎn)，將患者分為lncRNA ATB高表達(dá)組（lncRNA ATB≥9.34）及l(fā)ncRNA ATB低表達(dá)組（lncRNA ATB＜9.34）。不同性別、年齡、腫瘤位置的食管鱗狀細(xì)胞癌患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ATB表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的食管鱗狀細(xì)胞癌患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ATB表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.788、8.461、6.711、15.130，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的食管鱗狀細(xì)胞癌患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ATB的表達(dá)情況（n=95）

2.5 不同lncRNA ATB 相對表達(dá)量患者生存情況的比較

33例lncRNA ATB≥9.34的食管鱗狀細(xì)胞癌患者1年、2年、3年累積生存率分別為75.76%、57.58%、51.52%，明顯低于62例lncRNA ATB＜9.34患者的98.38%、83.87%、75.80%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.860、7.887、5.781，P＜0.05）。（圖2）

圖2 lncRNAATB≥9.34（n=33）及l(fā)ncRNAATB＜9.34（n=62）食管鱗狀細(xì)胞癌患者的生存曲線

2.6 食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存情況的影響因素分析

將性別（男=1，女=0）、年齡（≥60歲=1，＜60歲=0）、腫瘤位置（中、下段=1，上段=0）、腫瘤直徑（≥5 cm=1，＜5 cm=0）、分化程度（低分化=1，中、高分化=0）、TNM分期（Ⅲ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（是=1，否=0）、新輔助放化療（無=1，有=0）、lncRNA ATB（≥9.34=1，＜9.34=0）納入Cox單因素分析，結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、新輔助放化療及l(fā)ncRNA ATB可能與食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存情況有關(guān)。進(jìn)一步將TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、新輔助放化療及l(fā)ncRNA ATB納入Cox多因素分析，結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、新輔助放化療及l(fā)ncRNA ATB是食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存情況的影響因素。（表2）

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存情況的影響因素分析

3 討論

lncRNAATB定位于人類第14號染色體，長度為2246個核苷酸[9-10]。lncRNA ATB含有多個miRNA-200結(jié)合位點(diǎn)，可通過競爭性結(jié)合miRNA-200參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11-12]。已有研究證實(shí)，lncRNA ATB參與胃癌、胰腺癌及腎癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并與患者臨床特征及預(yù)后關(guān)系密切[13-15]。但關(guān)于lncRNA ATB與食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系未見報(bào)道，因此本研究對其進(jìn)行探討。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ATB相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織，提示lncRNA ATB可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生存在聯(lián)系。結(jié)合臨床特征發(fā)現(xiàn)lncRNA ATB表達(dá)情況與食管鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能有關(guān)，提示lncRNA ATB可能參與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展。本研究對食管鱗狀細(xì)胞癌患者進(jìn)行隨訪，了解患者預(yù)后情況，并比較不同預(yù)后患者的lncRNA ATB相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，死亡患者lncRNA ATB相對表達(dá)量明顯高于生存患者，因此推斷l(xiāng)ncRNA ATB或許可作為評估食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。為驗(yàn)證推斷，本研究通過構(gòu)建ROC曲線對lncRNA ATB評估食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的價值進(jìn)行分析，結(jié)果顯示lncRNA ATB評估患者預(yù)后的AUC為0.853，表明lncRNA ATB評估食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的效能較高。同時比較不同lncRNA ATB表達(dá)情況的食管鱗狀細(xì)胞癌患者的累積生存率發(fā)現(xiàn)，lncRNA ATB≥9.34的食管鱗狀細(xì)胞癌患者1年、2年、3年累積生存率明顯低于lncRNA ATB＜9.34的患者。上述結(jié)果提示lncRNA ATB可能與患者生存預(yù)后存在聯(lián)系，進(jìn)而本研究采用Cox單因素及多因素分析對食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存預(yù)后的影響因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、新輔助放化療及l(fā)ncRNA ATB是食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存預(yù)后的影響因素，lncRNA ATB相對表達(dá)量越高，食管鱗狀細(xì)胞癌患者的死亡風(fēng)險越高。

綜上所述，食管鱗狀細(xì)胞癌患者lncRNA ATB相對表達(dá)量升高，與患者的預(yù)后關(guān)系密切，檢測lncRNA ATB相對表達(dá)量有助于早期評估患者預(yù)后情況。此外本研究還為食管鱗狀細(xì)胞癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。本研究下一步將進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，對lncRNA ATB具體作用靶點(diǎn)及機(jī)制進(jìn)行探討。