miRNA-34a 通過靶向調(diào)控HGF 在喉癌中的作用及臨床意義

徐楊斌，洪藝云，李慧鳳，朱忠壽，劉平

福建醫(yī)科大學(xué)附屬寧德市醫(yī)院耳鼻咽喉科，福建 寧德 352000

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其中93%以上為鱗狀細胞癌，近年來喉癌的發(fā)病率呈增長趨勢，占全身腫瘤的1%～5%[1]。喉癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多基因、多步驟參與的過程，其發(fā)生可能與吸煙、飲酒、慢性炎癥、環(huán)境污染和生物因素有關(guān)。目前外科手術(shù)和放療是喉癌的主要治療方式，雖然治療技術(shù)有了較大進展，但由于喉癌早期癥狀不明顯，因此早期診斷和治療仍存在困難。加強對喉癌發(fā)生發(fā)展機制的研究，發(fā)現(xiàn)新的生物標志物已成為當(dāng)前研究的熱點之一[2]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種單鏈非編碼小分子RNA，可調(diào)控多種細胞的增殖、分化和凋亡過程，并在腫瘤的發(fā)展過程中具有重要的調(diào)控作用[3]。miRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，具有成為腫瘤標志物的潛力。有報道顯示，miRNA-25和miRNA-221在喉癌中表達異常[4-5]，miRNA-301a在喉癌中高表達，通過對SMAD4的調(diào)控促進喉癌細胞的增殖[6]。miRNA-375可抑制靶基因PDPK1的表達，從而促進喉癌細胞的凋亡[7]。近年來的研究顯示，miRNA-34a可調(diào)控多種腫瘤細胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移，通過作用于多種靶基因發(fā)揮抑癌作用[8]。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一種分泌型肝素親和糖蛋白，與肝素及硫酸軟骨素具有高度親和力，HGF/c-Met信號通路是由配體分子HGF作用于特異性受體c-Met，引起一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的酶促反應(yīng)，促發(fā)相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)的信號傳遞路徑。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成與HGF/c-Met信號通路密切相關(guān)。miRNA-34a與喉癌的關(guān)系目前尚不明確，本研究檢測miRNA-34a在喉癌患者中的表達情況，分析其對Hep-2細胞增殖、遷移及周期的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年6月至2019年3月于福建醫(yī)科大學(xué)附屬寧德市醫(yī)院治療的63例喉癌患者。所有患者均經(jīng)病理診斷為喉鱗狀細胞癌，術(shù)前未接受放化療。收集喉癌患者的喉癌組織63例和遠離手術(shù)陰性切緣的癌旁正常組織63例，于-80℃冰箱保存。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

使用含10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的 RPMI1640 培養(yǎng)基于 5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)Hep-2細胞。將Hep-2細胞分為miRNA-NC組、miRNA-34a mimics組及miRNA-34a mimics+HGF組，各組按照說明書分別轉(zhuǎn)染negative control miRNA mimics、miRNA-34a mimics及miRNA-34a mimics+HGF。

1.3 熒光素酶報告基因檢測

構(gòu)建HGF野生型3'-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒pMIR-HGF-wt，并以pMIR-HGF-wt質(zhì)粒為模板，利用聚合酶鏈反應(yīng)搭橋法構(gòu)建其潛在結(jié)合位點突變型報告基因質(zhì)粒pMIR-HGF-Mut。將構(gòu)建的pMIR-HGF-Wt質(zhì)粒、pMIR-HGF-Mut質(zhì)粒與miRNA-34a mimics和negative control miRNA mimics共轉(zhuǎn)染進Hep-2細胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，去除培養(yǎng)基，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細胞3次，棄去PBS，每孔中加入100 μl被動裂解液（passive lysis buffer，PLB），室溫下將培養(yǎng)板置于平板搖床上，輕微晃動15 min。待細胞裂解后，將每組20 μl樣本轉(zhuǎn)移至發(fā)光用96孔板上，并置于酶標儀的檢測板上，設(shè)置自動進樣器1和2分別分裝100 μl的LARⅡ和Stop&Glo試劑。測量時，使用1～2 s延遲和5～10 s讀數(shù)。如此循環(huán)操作直至所有樣本檢測完畢。使用酶標儀配套軟件進行結(jié)果分析。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測miRNA-34a的表達水平

取喉癌組織和癌旁正常組織，按照Trizol試劑盒說明書中的步驟提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒檢測miRNA-34a的表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測HGF蛋白表達

miRNA-NC組、miRNA-34a mimics組Hep-2細胞轉(zhuǎn)染36 h后，采用IP裂解液收集細胞。按照Western blot操作流程檢測HGF蛋白的表達水平。

1.6 CCK8檢測細胞增殖

參照CCK8試劑盒說明書步驟進行檢測，miRNANC組、miRNA-34a mimics組及miRNA-34a mimics+HGF組細胞轉(zhuǎn)染24 h后，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入10 μl CCK8，37 ℃培養(yǎng)2 h，酶標儀上于480 nm波長處測定光密度（optical density，OD）值，計算細胞的增殖率。實驗重復(fù)3次。

1.7 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移

miRNA-NC組、miRNA-34a mimics組及miRNA-34a mimics+HGF組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，將單細胞懸液接種于12孔細胞培養(yǎng)板。待細胞長成單層后棄去培養(yǎng)液，在每孔中央劃出一個劃痕，洗去死細胞后，顯微鏡下拍照。利用軟件測量并計算培養(yǎng)24 h后細胞的遷移率。實驗重復(fù)3次。

1.8 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

miRNA-NC組、miRNA-34a mimics組及miRNA-34a mimics+HGF組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，懸浮并收集培養(yǎng)后的細胞并應(yīng)用70%乙醇固定。加入碘化丙啶，4℃冰箱避光染色30 min，待樣本形成單細胞懸液后，采用流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉癌組織和癌旁正常組織中miRNA-34a表達情況的比較

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，喉癌組織中miRNA-34a的表達水平為（0.26±0.06），明顯低于癌旁正常組織的（1.00±0.15），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=42.335，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征喉癌患者喉癌組織中miRNA-34a 表達情況的比較

喉癌組織中miRNA-34a的表達水平為（0.26±0.06），以miRNA-34a表達水平≥0.26為高表達，＜0.26為低表達。63例患者中，miRNA-34a高表達24例，低表達39例。不同年齡、性別、分化程度、臨床分期的喉癌患者喉癌組織中miRNA-34a的表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者喉癌組織中miRNA-34a的高表達率明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征喉癌患者喉癌組織中miRNA-34a表達情況的比較（n=63）

2.3 miRNA-34a對HGF的靶向調(diào)控

miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，miRNA-34a與HGF的3'-UTR具有結(jié)合位點，HGF是miRNA-34a的潛在靶基因。為驗證miRNA-34a與HGF的靶向關(guān)系，本研究構(gòu)建了HGF野生型3'-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒pMIR-HGF-wt及突變型報告基因質(zhì)粒pMIR-HGF-Mut。將negative control miRNA mimics、miRNA-34a mimics和構(gòu)建的 pMIR-HGF-wt質(zhì)粒及pMIR-HGF-Mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進Hep-2細胞中，雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miRNA-34a mimics和pMIR-HGF-wt細胞的熒光素酶活性為（4.56±0.52），明顯低于miRNA-NC組的（19.25±1.17），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.873，P＜0.01）。共轉(zhuǎn)染miRNA-34a mimics和pMIR-HGF-Mut細胞的熒光素酶活性為（19.96±6.37），低于miRNA-NC組的（23.56±6.69），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 miRNA-34a對HGF mRNA和蛋白表達的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miRNA-34a mimics組Hep-2細胞中HGFmRNA的表達水平為（0.41±0.05），明顯低于miRNA-NC組的（1.00±0.16），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.096，P＜0.01）。Western blot檢測結(jié)果顯示，miRNA-34a mimics組Hep-2細胞中HGF蛋白表達水平低于miRNA-NC組（圖1）。

圖1 Western blot檢測HGF蛋白表達

2.5 miRNA-34a和HGF對細胞增殖、遷移及周期的影響

CCK8檢測結(jié)果顯示，miRNA-34a mimics組細胞的增殖率明顯低于miRNA-NC組，miRNA-34a mimics+HGF組細胞的增殖率明顯高于miRNA-34a mimics組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，miRNA-34a mimics組S期細胞比例明顯低于miRNA-NC組，miRNA-34a mimics+HGF組S期細胞比例明顯高于miRNA-34a mimics組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。細胞劃痕實驗檢測結(jié)果顯示，miRNA-34a mimics組細胞遷移率明顯低于miRNA-NC組，miRNA-34a mimics+HGF組細胞遷移率明顯高于miRNA-34a mimics組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 不同組別Hep-2細胞增殖、遷移及周期情況的比較（±s）

表2 不同組別Hep-2細胞增殖、遷移及周期情況的比較（±s）

注：a與miRNA-NC組比較，P＜0.01；b與miRNA-34a mimics組比較，P＜0.01

指標增殖率（%）S期細胞比例（%）遷移率（%）0.59±0.08 11.36±0.62 21.06±1.15 0.36±0.01a 5.93±0.31a 17.03±0.64a 0.75±0.03a b 18.45±0.69a b 32.56±2.13a b miRNA-NC組miRNA-34a mimics組miRNA-34a mimics+HGF組

3 討論

喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，其早期癥狀不明顯，而腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移嚴重限制了治療效果[9]。因此，研究喉癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找喉癌早期診斷的生物標志物對喉癌的早期治療及預(yù)后具有重要意義[10]。目前的研究顯示，許多特異性miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，具有成為腫瘤診治靶點的潛力。miR-NA是一類高度保守的長度為21～23個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，其通過堿基配對的方式與靶基因的3'-UTR結(jié)合從而導(dǎo)致靶基因的mRNA降解[11]。miRNA參與細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等生物學(xué)行為，并作為促癌或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制miRNA-21的表達可促進喉癌細胞的凋亡，抑制喉癌細胞的增殖和遷移[12]。Cao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21、miRNA-93、miRNA-205和miRNA-708在喉癌組織中表達升高，miRNA-145和miRNA-125b在喉癌組織中表達降低。Yu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-206在喉癌組織中表達降低，且其表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。這些研究結(jié)果表明miRNA的異常表達與喉癌的發(fā)展過程密切相關(guān)。

miRNA-34a是miRNA-34家族成員之一，近年來有研究顯示，miRNA-34a可以抑制肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌的發(fā)展，在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用[15-17]。然而miRNA-34a對喉癌的影響目前鮮有報道。本研究采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a在喉癌組織中的表達水平明顯低于癌旁正常組織，進一步分析發(fā)現(xiàn)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者喉癌組織中miRNA-34a的高表達率明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。表明miRNA-34a可能與喉癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的關(guān)系。

HGF是一種多功能的細胞因子，主要由成纖維細胞、巨噬細胞等間質(zhì)細胞產(chǎn)生。HGF不僅參與調(diào)控多種組織器官的生長發(fā)育及修復(fù)，還能夠促進腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲，加速惡性腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移，誘發(fā)腫瘤新生血管的形成，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。HGF主要通過與其受體c-Met形成HGF/c-Met信號通路，發(fā)揮生物學(xué)作用。HGF與c-Met受體的胞外區(qū)結(jié)合后，激活c-Met胞內(nèi)酪氨酸激酶的活性并發(fā)生自身磷酸化，激活的c-Met使多種底物酪氨酸蛋白磷酸化，進而促發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)。HGF/c-Met信號通路不僅可調(diào)控正常細胞的黏附、分化和遷移，調(diào)節(jié)胚胎、肺、腎等器官的發(fā)育及組織損傷修復(fù)，還與腫瘤的生長和浸潤密切相關(guān)。研究顯示，HGF/c-Met參與了甲狀腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、肝癌、頭頸部腫瘤等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。干擾HGF的表達或阻滯HGF/c-Met信號通路可抑制腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、浸潤及血管形成。Uchida等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，HGF在口腔鱗狀上皮細胞癌患者血清中的表達水平明顯升高；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者相比，HGF在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清中的表達水平明顯升高；正常喉黏膜組織中HGF低表達。Sawatsubashi等[20]研究發(fā)現(xiàn)，HGF/c-Met在喉鱗狀上皮細胞癌及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中均出現(xiàn)高表達。Yücel等[21]研究納入60例聲門上型喉癌患者，發(fā)現(xiàn)c-Met在90%的瘤體及83%的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中高表達。Jiang等[22]報道顯示，NK4可通過與c-Met穩(wěn)定結(jié)合且不活化c-Met從而競爭性抑制HGF，進而抑制其促進腫瘤發(fā)展的作用。本研究通過miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測HGF是miRNA-34a的潛在靶點之一，而熒光素酶報告基因結(jié)果驗證了miRNA-34a能夠與HGF的3'-UTR特異性結(jié)合。qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果也顯示，miRNA-34a可以抑制HGF的mRNA和蛋白表達。提示miRNA-34a可能通過靶向作用于HGF參與喉癌的發(fā)生發(fā)展過程。

腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡是腫瘤發(fā)展過程中重要的生物學(xué)行為。本研究通過CCK8法、細胞劃痕實驗及流式細胞術(shù)進一步分析了miRNA-34a和HGF對Hep-2細胞增殖、遷移及周期的影響。結(jié)果顯示，與miRNA-NC組比較，miRNA-34a mimics組的細胞增殖率、遷移率及S期細胞比例均較低，然而這種變化會被HGF過表達逆轉(zhuǎn)。表明miRNA-34a可通過抑制HGF的表達抑制喉癌細胞的增殖、遷移和S期細胞周期的聚集，在喉癌中發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，miRNA-34a通過結(jié)合靶基因HGF的3'-UTR抑制其mRNA和蛋白表達，在喉癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用。miRNA-34a表達情況與喉癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，提示miRNA-34a可能成為喉癌診斷及治療的潛在新靶點。