HPLC一測多評法同步測定玳玳果黃酮降脂提取物4個效應組分含量

馬國萍，陳 丹，朱仙慕，劉秀棉，洪麗婷，陳 思

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

一測多評法［1］（quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS）是指利用中藥有效成分的內在函數(shù)關系和比例關系，在只測定一個成分的情況下，實現(xiàn)多個成分的同步測定，本法對于解決中藥對照品制備困難或價格昂貴的狀況具有實際的應用價值。玳玳（Citrus aurantium L.var daidai Tanaka）屬蕓香科柑桔亞屬植物，為酸橙變種，藥食同源中藥［2］，在我國福建、四川、浙江等地都有栽培。課題組前期研究表明：由玳玳果分離制備的玳玳果黃酮提取物具有良好的降脂抗氧化作用，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷等為其主要效應組分，其中柚皮苷、新橙皮苷成分占總黃酮含量的60%以上［3-6］，但橙皮內酯水合物、枳屬苷對照品較難獲得。為有效控制玳玳果黃酮降脂提取物質量，利用HPLC一測多評法（QAMS）建立同步測定玳玳果黃酮降脂提取物4個主要效應組分柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷含量，并與HPLC外標法（ESM）結果比較，以期建立運用單一對照品，多指標組分群控制玳玳果黃酮降脂提取物質量，為玳玳果黃酮降脂提取物質量控制標準的制訂提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2996 PDA檢測器、Empower 3色譜工作站（美國Waters公司）；XS205十萬分之一電子天平、AR2140萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ3200型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 柚皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度＞98%，批號：110722-201111）；新橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度＞98%，批號：111857-201001）；橙皮內酯水合物（實驗室自制，純度為98.9%）；枳屬苷（實驗室自制，純度為98.7%）；玳玳果黃酮提取物（自制，總黃酮含量在803.7～887.9 mg／g），批號分別為 20181015（批 1）、20181114（批 2）、20181201（批 3））；乙腈為色譜純；水為超純水：其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制 分別精密稱取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷對照品適量，分別加甲醇溶解，制得質量濃度為0.597 mg／mL的新橙皮苷對照品溶液、質量濃度為0.518 mg／mL的柚皮苷對照品溶液、質量濃度為0.275 mg／mL的橙皮內酯水合物對照品溶液、質量濃度為0.328 mg／mL的枳屬苷對照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制 精密稱取玳玳果黃酮降脂提取物約10.0 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 陰性對照品溶液的配制 取缺玳玳果黃酮降脂提取物的溶劑，按“2.2”項下同法操作，即得。

2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱Lichrocart C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相 A 為乙腈，B為0.2%冰醋酸水溶液，梯度洗脫［0～10 min AB（22∶78）；10～20 min A-B（35∶65）；20～25 min A-B（48∶52）；25～30 min A-B（22∶78）］；流速 1.0 mL／min；檢測波長 284 nm；柱溫 30℃；進樣量 10 μL。柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內酯水合物及枳屬苷的色譜峰分離度均R＞1.5，理論塔板數(shù)按柚皮苷計大于3 000。結果見圖1。

圖1 對照品、陰性對照和供試品的HPLC色譜圖

2.5 標準曲線制備及線性關系考察 分別精密吸取不同體積的柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷對照品貯備溶液，制成不同濃度的系列混合對照品溶液。精密吸取系列混合對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標，對照品質量濃度為橫坐標，最小二乘法線性回歸，繪制標準曲線。實驗結果表明：柚皮苷濃度在31.377～159.188 μg／mL 范圍內線性關系良好，回歸方程為 Y＝1.656×107X-2.620×104（r＝0.999 5）；新橙皮苷濃度在63.632～208.123 μg／mL范圍內線性關系良好，回歸方程為Y＝1.899×107X-1.841×104（r＝0.999 8）；橙皮內酯水合物濃度在 3.899～12.241 μg／mL范圍內線性關系良好，回歸方程為Y＝9.090×106X-1.578×103（r＝0.999 6）；枳屬苷濃度在 2.696～17.366 μg／mL范圍內線性關系良好，回歸方程為 Y＝1.490×107X-8.179×103（r＝0.999 4）。

2.6 精密度試驗 分別精密吸取同一供試品溶液各 10 μL，連續(xù)進樣 6 次，按“2.4”項下同法操作，測得柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內酯水合物及枳屬苷峰面積 RSD分別為 0.34%、0.48%、0.92%、1.09%，結果表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 取同一批玳玳果黃酮降脂提取物（批號：20181114），分別精密稱取 6 份，按“2.2”和“2.4”項下同法操作，測得柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內酯水合物及枳屬苷的平均含量分別為288.50、368.70、26.04、15.05 mg／g，RSD 值 分 別 為 2.47% 、2.27%、2.40%、2.48%，結果表明方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取 10 μL 注入高效液相色譜儀，按“2.4”項下同法操作，記錄柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內酯水合物及枳屬苷的峰面積值，計算得峰面積的 RSD值分別為 0.85%、0.42%、1.95%、1.29%，結果表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取干燥至恒重的玳玳果黃酮降脂提取物，分別精密稱取約5 mg（批號：2018 1114），共6份，精密加入適量對照品溶液（每1 mL含柚皮苷0.520 mg、新橙皮苷 1.501 mg、橙皮內酯水合物 0.275 mg、枳屬苷 0.328 mg），按“2.2”“2.4”項下同法操作、測定，計算得柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷的平均回收率分別為97.99%、101.50%、98.21%、95.56%，RSD 分別為 2.07%、2.80%、2.92%、2.32%，結果表明方法準確度良好。

2.10 內參物的選擇及相對校正因子的計算 精密吸取含4組分系列混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣 6 次，按“2.2”和“2.4”項下同法操作、測定，分別以新橙皮苷、柚皮苷（k）為內參物，峰面積數(shù)據(jù)代入公式（1）分別計算內參物與其他3個組分的相對校正因子（fkm）和RSD值，比較確定內參物。

式中fk為內參（柚皮苷或新橙皮苷）的相對校正因子，fm為其他3個待測組分如新橙皮苷或橙皮內酯水合物或枳屬苷的相對校正因子，Wm為待測組分的量，Am為待測組分的峰面積值，Wk為內參的量，Ak為內參的峰面積值。

2.1 0.1 以新橙皮苷為內參物 通過HPLC外標法測定一系列不同濃度的對照品溶液及對應的峰面積，按“2.10”項下公式（1），計算各成分與內參物新橙皮苷的相對校正因子，計算出相應的平均值，并計算RSD。見表1。

2.1 0.2 以柚皮苷為內參物 通過HPLC外標法測定一系列不同濃度的對照品溶液及對應的峰面積，以柚皮苷為內參物，按“2.10”項下公式（1），計算各成分與內參物柚皮苷的相對校正因子，計算出相應的平均值，并計算RSD。見表2。

2.11 樣品含量測定 分別取三批玳玳果黃酮降脂提取物，按“2.2”和“2.4”項下同法操作、測定。 采用ESM、QAMS分別測定玳玳果黃酮降脂提取物中柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內酯水合物及枳屬苷的含量。QAMS分別以新橙皮苷、柚皮苷為內參物應用公式（2），計算玳玳果黃酮提取物中柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內酯水合物及枳屬苷的含量。定量公式（2）由公式（1）導出。結果見表3、表4。

式中，Wm為待測組分的量，Am為待測組分的峰面積值，Wk為內參的量，Ak為內參的峰面積值，fkm為內參k與待測組分m相對校正因子。

表1 以新橙皮苷為內參物的fk／m測定結果

表2 以柚皮苷為內參物的fk／m測定結果

表3 以新橙皮苷為內參物的QAMS與ESM含量測定結果比較（n＝3，Q／RSD%）mg／g

表4 以柚皮苷為內參物的QAMS與ESM含量測定結果比較（n＝3，Q／RSD%）mg／g

2.12 QAMS與ESM測定結果比較 取三批玳玳果黃酮降脂提取物，以QAMS計算4個效應組分含量，與采用ESM測得的各效應組分含量比較，考察QAMS的準確度。結果表明：以新橙皮苷為內參物時，QAMS與ESM的測定結果無顯著性差異（P＞0.05），同樣，以柚皮苷為內參物時，兩種方法的測定結果也無顯著性差異（P＞0.05），提示建立的 QAMS計算結果準確可靠，可用于玳玳果黃酮降脂提取物4個效應組分含量測定。同時，考慮到柚皮苷對照品較新橙皮苷對照品更為經(jīng)濟，故確定選擇以柚皮苷為內參物的QAMS，建立同步測定玳玳果黃酮降脂提取物4個主要效應組分含量測定。見表3、表4。

2.13 QAMS法與ESM測定結果的統(tǒng)計分析評價采用SPSS 18.0軟件的相關系數(shù)法，分別對三批玳玳果黃酮降脂提取物的4個效應組分平均含量測定結果進行線性回歸分析，利用Pearson相關系數(shù)評價結果。比較兩種方法測得結果的相關性，并計算相對誤差，判別QAMS用于玳玳果黃酮降脂提取物中4個效應組分同步含量測定結果的準確性與差異性。結果表明：采用QAMS同時測定玳玳果黃酮降脂提取物中4個效應組分含量與ESM分別測定的含量結果呈正向直線相關（P＜0.05），QAMS和ESM測定的4個效應組分含量結果無顯著性差異（P＞0.05），因此以柚皮苷或新橙皮苷為內參物的QAMS用于玳玳果黃酮降脂提取物多指標成分群的質量控制評價是可行的。

3 討 論

實驗曾比較乙腈-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.2%冰醋酸水溶液的等度洗脫與梯度洗脫程序。結果表明：以乙腈-0.2%冰醋酸水溶液為流動相，梯度洗脫，供試品中各組分均達基線分離且峰型良好，各組分的保留時間、峰面積的穩(wěn)定性和重復性良好。

比較不同柱溫（20、25、30、35 ℃）對色譜峰分離的影響，結果表明：在柱溫30℃，進樣量10 μL條件下，基線平穩(wěn)，新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷色譜峰峰形完整且穩(wěn)定，各色譜峰達到完全分離。另外，曾考察不同品牌色譜柱、不同高效液相色譜儀對色譜峰定位及色譜響應因子（CRF）值穩(wěn)定性影響，結果表明：在不同高效液相色譜儀上使用 Lichrocart C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行分析測定時，各組分的峰型均良好且CRF值穩(wěn)定，故選擇采用該色譜柱建立玳玳果黃酮降脂提取物的同步測定4個效應組分的HPLC一測多評法。

課題組前期研究表明：玳玳果黃酮降脂提取物的主要效應組分為柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷等，采用常規(guī)的外標法建立玳玳果黃酮降脂提取物的含量測定方法，同時測定4個效應組分含量，需要4個對照品，因橙皮內酯水合物、枳屬苷對照品缺乏且價格昂貴，所以實驗分別選取對照品簡便易得且含量較高的新橙皮苷、柚皮苷作為內參物，計算4個效應組分含量。與采用ESM測得的各效應組分含量比較，兩種方法的測定結果間均無顯著性差異。在此基礎上，綜合考慮因柚皮苷對照品較新橙皮苷對照品更為經(jīng)濟，故選擇柚皮苷為內參物，建立同步測定玳玳果黃酮降脂提取物4個主要效應組分的QAMS，使適合中藥玳玳果降脂提取物多組分、多層次、多靶點的特性，達到多指標質量控制的目的。

實驗利用玳玳果黃酮降脂提取物主要效應組分間的相互關系，建立QAMS同步測定提取物4個效應組分含量，判別QAMS用于玳玳果黃酮降脂提取物中4個效應組分同步含量測定結果的準確性與差異性。結果表明：采用ESM與QAMS法測定的含量結果呈正向直線相關，計算的含量結果之間沒有顯著性差異，驗證了QAMS的準確性。研究建立的QAMS準確可靠，簡便可行，可用于玳玳果黃酮降脂提取物的多指標質量的定量監(jiān)控。