白菜類作物開花時間相關基因CCA1的克隆及功能標記開發

劉東讓 侯喜林 肖棟

摘要：以1年生的油用型品種Yellow sarson（YS-143）與2年生的蕪菁品種Vegetable turnip（VT-044）的cDNA為模板，克隆出CCA1基因cDNA全長序列，分析其核苷酸多態性。在這2份材料構建的200株F2分離群體中，選取極早和極晚開花的單株各24株，對在親本上鑒定到的4個多態性位點進行PCR擴增，采用Pearson相關性分析研究基因型與開花時間表現型的關系。構建pEZS-NL-CCA1載體，利用亞細胞定位技術，分析CCA1基因在真核細胞中的表達情況。序列分析表明，YS-143與VT-044分別有1 665、1 647個核苷酸，分別編碼了554、548個氨基酸。親本之間核苷酸序列分析鑒定到12個差異位點，氨基酸同源進化樹分析表明，十字花科的不結球白菜、大白菜、蘿卜、油菜、擬南芥、亞麻芥聚集在同一分支中，而禾本科的大麥、玉米、水稻聚集在另一分支中。在F2分離群體上，Pearson相關性鑒定到位于親本第727至第732個堿基處的1個多態性位點（ACCCTT/ACCCTT），有該位點的群體單株平均開花時間為39 d，極顯著早于缺失該位點的群體單株平均開花時間104 d（P<0.01），表明白菜類作物CCA1基因的第727至第732個堿基的缺失（A05：472204-472209）與開花時間呈極顯著相關，影響開花時間，可為光周期敏感的白菜類作物晚抽薹育種研究提供一定的理論依據。開發的該Insert/Delete（InDel）標記，可以作為功能分子標記進行輔助育種工作，以加快育種進程。亞細胞定位結果表明，CCA1基因主要在細胞核上表達。

關鍵詞：白菜類作物;開花時間;CCA1;InDel標記;亞細胞定位

中圖分類號： S634.01?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0084-07

白菜類作物（Brassica rapa）屬于十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica），是我國乃至世界范圍內重要的蔬菜和油料作物，主要包括大白菜、小白菜、蕪菁、菜薹、紫菜薹、白菜型油菜等多種類型[1]。油用白菜類作物包括春性和冬性歐洲生態類型、我國特有的白菜型油菜和印度的Sarson類型，以根莖膨大為主要特征的蕪菁類型是較原始的白菜類作物栽培種[2]。白菜類作物在開花習性上有1年生和2年生之分，在抽薹、開花時間上存在很大的差異。因此，白菜類作物是研究抽薹、開花變異、育種和遺傳的良好體系[3]。

開花時間是白菜類作物生產中重要的農藝性狀，是其從營養生長到生殖生長的重要標志，先抽薹、開花的現象直接影響了其產量和品質[4-5]。開花時間是由其內源發育信號和多種環境因素共同調控的，其中環境溫度和光周期是主要影響因子[6]。Nelson等對起源于歐洲和澳大利亞的1年生夏季甘藍型油菜進行了光周期敏感性觀察，同時對不同光周期（長日照、短日照）條件下的131份雙單倍體（double haploid）群進行了開花時間（天數）和開花時葉片數調查，發現該親本及群體開花時間受光周期影響[7]。Huang等的研究表明，植物開花的光周期調控途徑涉及復雜的晝夜節律（生物鐘）調控網絡，晝夜節律（生物鐘）核心振蕩子包括CCA1和LATEELONGATEDHYPOCOTYL（LHY）等MYB類轉錄因子[8]。在擬南芥中，CCA1基因通過與TIMING OF CABEXP RESSION 1（TOC1）和LHY基因相互作用形成一個生物鐘的反饋環，即CCA1和LHY基因表達達到一定量會抑制TOC1基因的表達，而TOC1基因表達量升高則會促進CCA1和LHY基因表達，進而調控植物對晝夜變化做出響應，是維持生物鐘節律的必需組分[9-11]。研究者已經在蕓薹屬的多種類型中測序發現，CCA1存在多個多態性位點，表明CCA1序列變異可用于開發與育種性狀相關的分子標記[12]。張志剛等利用CCA1基因在2個敏感性不同的大白菜品種上第329 bp（第4外顯子）處和第1 407 bp（第7外顯子）處的2段序列差異開發出2個InDel標記，用于區分2個大白菜品種的耐抽薹性[13]。Yi等對3個蕪菁自交系（RCBr、Kenshin 和Chiifu）的DNA序列進行分析，在CCA1基因第4內含子上開發出1個InDel標記[12]。白菜類作物種類繁多，僅在大白菜和蕪菁上進行克隆序列的比較和標記的開發具有一定局限性，而且一般認為外顯子上的變異比內含子上的變異更有可能影響植物的表型。在我國春季及高寒地區的秋冬白菜類作物生產中，先期抽薹、開花常常成為降低蔬菜產量和品質的重要難題[1]。因此，選育耐抽薹、晚開花的優質新品種，已經成為白菜類作物育種中的重要目標，開發白菜類作物不同類型CCA1基因的分子標記，可為分子標記輔助育種提供一定的理論依據[14]。

本研究選用早開花的油用型品種YS-143與晚開花的蕪菁品種VT-044為試材，分別觀察其在長日照和短日照2個條件下的開花時間，同時以這2個材料為模板克隆CCA1基因的cDNA序列，并利用生物信息學技術對其氨基酸序列進行分析，開發出1個InDel標記，最后通過驗證，將其作為功能標記進行輔助育種工作，同時利用亞細胞定位技術鑒定了CCA1基因在細胞中的表達位置。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

以白菜類作物中純合的1年生油用型品種YS-143（B. rapa L. ssp. oleifera）和2年生蕪菁品種VT-044（B. rapa L. em. Metzg. ssp. rapa）及它們構建的F2分離群體為試材。親本用于不同光周期對開花時間的敏感性觀察及鑒定多態性差異位點，F2代分離群體用于多態性差異位點的驗證。

RNAsimple Total RNA Kit試劑盒、PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，購自TaKaRa公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，購自Axygen公司;pEAZY-Blunt載體及大腸桿菌感受態細胞DH5α購自北京全式金生物技術有限公司;高保真酶MIX（Ⅰ-5TM2×High-Fidelity Master Mix）購自江蘇南京擎科生物科技有限公司;JS-3000全自動凝膠成像分析儀，購自上海培清科技有限公司。

1.2?試驗方法

1.2.1?光周期敏感試驗?2017年8月3號，將親本材料種子20粒分別在鋪有濾紙的培養皿里催芽，25 ℃暗培養36 h后播種在穴盤里，分別置于長日照（光照16 h/黑暗8 h）、短日照（光照8 h/黑暗16 h），溫度22 ℃/18 ℃，相對濕度70%，光照度72 μmol/（m2·s）的光培箱中生長，1個月后定植花盆（17 cm）。同時，將F2代分離群體200株也播種在穴盤中，置于塑料大棚生長3周以后，于2017年8月24日至12月26日定植于南京農業大學句容農博園塑料大棚內，按照單株順序編號，正常田間管理。調查親本和F2代分離群體的開花時間，調查標準為從催芽到第1朵花開放所需要的時間（天數）。

1.2.2?CCA1基因克隆?使用RNAsimple Total RNA Kit試劑盒提取2個親本的總RNA，具體方法參照說明書。cDNA使用PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉錄合成，作為基因克隆所需的模板。CCA1基因序列參照已發表的大白菜基因組序列（http：//brassicadb.org/brad/），使用在線軟件Primer 3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設計特異擴增的PCR引物，并由江蘇南京擎科生物科技有限公司合成（表1）。PCR擴增體系總體積為40 μL：正反引物各 2 μL、模板cDNA 1 μL、高保真酶MIX 20 μL、ddH2O 15 μL。PCR反應程序：98 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸10 s，35個循環;72 ℃延伸5 min;10 ℃保存。cDNA質量的檢驗采用瓊脂糖凝膠電泳方法，取5 μL DNA加入6×Loading Buffer后用1.2%瓊脂糖電泳檢測，GelRed染色，用JS-3000全自動凝膠成像分析儀進行凝膠照相。凝膠回收方法參照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒。目的片段膠回收后連接到pEAZY-Blunt載體上，轉化進大腸桿菌感受態細胞DH5α中，選擇陽性單克隆送至江蘇南京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.3?序列分析?用BioXM 2.7軟件分析2份材料CCA1基因序列的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。不同物種CCA1基因的氨基酸序列從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中搜索獲得;同源性計算利用NCBI網站BLAST程序;氨基酸編碼的蛋白質相對分子質量、理論等電點、不穩定指數等通過在線軟件ProtParam（https：//web. expasy.org/Protparam/）完成;親/疏水性預測采用ProtScale（https：//web. expasy.org/protscale/）;信號肽預測采用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）;跨膜區域預測采用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）;蛋白質結構域分析采用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）;蛋白質二級結構預測采用PSIPRED（http：// bioinf.cs.ucl.ac.uk /psipred/）等在線工具;多重序列比對及進化樹構建通過DNAMAN 5.2進行[15]。

1.2.4?功能標記開發?提取F2代群體極早和極晚開花植株各24株葉片的DNA，具體方法參照Axygen植物基因組DNA提取試劑盒說明書。對親本中鑒定到的CCA1編碼區多態性位點（InDels）設計特異引物進行PCR擴增，擴增產物送江蘇南京擎科生物科技有限公司測序（表1）。采用t測驗分析親本的開花時間差異顯著性。以InDel標記基因型作為自變量，采用單因素方差分析候選標記（InDel）與開花時間表型的相關性，統計學分析過程中所用的軟件是SPSS 19.0。

1.2.5?CCA1基因的亞細胞定位分析?根據YS-143中克隆出的CCA1基因序列和亞細胞定位載體pEZS-NL序列，設計含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點的特異引物（表1）。用One Step Cloning Kit構建載體pEZS-NL-CCA1，具體操作方法參照說明書。用基因槍法轉化洋蔥表皮細胞[16]，取洋蔥表皮，將其靠葉肉面向上鋪于MS固體培養基上培養4 h待用，取8 μL金粉懸浮液于1.5 mL離心管中，依次加入5 μg質粒DNA、50 μL 2.5 mol/L CaCl2、20 μL 0.1 mol/L亞精胺，冰浴20 min，其間間歇振蕩混勻。10 000 r/min離心5 s，棄上清，加入無水乙醇漂洗2次，棄上清，最后加入20 μL無水乙醇，懸浮待用。用基因槍轟擊洋蔥表皮，轟擊后暗培養16 h制片，用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，并拍照記錄。

2?結果與分析

2.1?親本開花時間統計

由圖1可知，10株親本材料YS-143在長日照條件下平均開花時間為（48±10） d，短日照條件下為（96±10） d;10株VT-044在長日照條件下平均開花時間為（105±15） d，短日照條件下在統計時間內沒有開花，記為200 d。通過t測驗發現，這2個親本在不同光周期處理下的開花時間均差異極顯著。由此證明，2個親本開花時間均受光周期影響，均為光周期敏感性材料。

2.2?CCA1基因克隆及序列分析

由圖2可知，YS-143的cDNA序列長度為1 665 bp，VT-044的序列長度為1 647 bp，除了前者比后者多了4段共18 bp的插入外，整個編碼區還有8處SNPs，其中2處是非同義突變。經預測，第1段插入使YS-143的CCA1蛋白第110位后的氨基酸插入Arg和Lys 2個殘基;第2段插入使 YS-143的CCA1蛋白第242位后的氨基酸插入Thr和Leu 2個殘基;第3段使YS-143的CCA1蛋白第263位后的氨基酸插入Gly殘基;第4段使YS-143的CCA1蛋白第504位后的氨基酸插入Leu殘基;另外2處非同義突變分別是 YS-143 的CCA1蛋白第158位氨基酸由Val突變為Leu、第467位氨基酸由Gln突變為Lys。

由圖3可知，YS-143的基因序列包含1個長為1 665 bp的ORF;該基因編碼554個氨基酸，預測其編碼蛋白質化學式為C2591H4095N781O867S14，相對分子質量為60.5 ku，理論等電點為6.20，不穩定指數為46.60，脂肪指數為57.33。ProtScale親/疏水性預測顯示，該蛋白屬于親水性蛋白，平均親水指數為-0.872。蛋白二級結構預測結果顯示，其主要為α螺旋和無規則卷曲，分別占21.01%、76.45%，其余為延伸鏈。VT-044 的基因序列包含1個長為1 647 bp的ORF;該基因編碼548個氨基酸，預測其編碼蛋白質化學式為 C2559H4033N771O861S14，相對分子質量為59.8 ku，理論等電點為5.98，不穩定指數為46.18，脂肪指數為56.35。ProtScale親/疏水性預測顯示，該蛋白屬于親水性蛋白，平均親水指數為 -0.877。蛋白二級結構預測結果顯示，其主要為α螺旋和無規則卷曲，分別占23.5%、73.59%，其余為延伸鏈。2個基因所編碼蛋白質均屬于不穩定蛋白，無信號肽和分泌蛋白，也不存在跨膜區域，并且均在第19至第73氨基酸區域內有3個MYB-DNA結合域。

2.3?CCA1基因編碼的氨基酸序列同源性和系統進化分析

利用BLASTp分別對YS-143和VT-044的CCA1氨基酸序列進行同源性檢索與多重比對，結果（圖4、圖5）顯示它們與大白菜（登錄號為XP_009142594.1）相似性接近100%，與甘藍型油菜（登錄號為XP_013712324.1）和蘿卜（登錄號為XP_018441166.1）相似性分別為92%、73%，與擬南芥（登錄號為NP850460.1）和亞麻芥（登錄號為XP_010518363.1）相似性在65%以上，其中N端的MYB-DNA結合域的氨基酸序列相似度接近100%;與大麥（登錄號為BAJ92173.1）、玉米（登錄號為BAJ92173.1）和水稻（登錄號為AAR20887）的相似性均在35%以下，表明同科植物的氨基酸序列相似度較高。同源進化樹分析表明，十字花科的不結球白菜、大白菜、蘿卜、甘藍型油菜、擬南芥、亞麻芥聚集在同一分支中，而禾本科的大麥、玉米、水稻聚集在另一分支中。

2.4?功能標記開發

將4個InDel標記在極早和極晚開花植株上的測序結果與植株開花時間進行關聯分析，發現第2處標記（第727至第732個堿基的缺失）與材料開花時間關聯極顯著，其余3處不顯著。測序發現在F2代的24株極早開花的植株中，該位點基因型為ACCCTT/ACCCTT的有18株（與早花型母本YS-143一致），占總株數的75%，開花時間為31～56 d，平均開花時間39 d，基因型為ACCCTT/-的有3株，-/-的有3株;在24株極晚開花的植株中，該位點基因型為ACCCTT/ACCCTT的有0株，ACCCTT/-的有4株，基因型為-/-的有20株（與晚花型父本VT-044一致），占總株數的83%，開花時間為84～114 d，平均開花時間為104 d。因此，該位點基因型為ACCCTT/ACCCTT的植株開花時間遠早于基因型為-/-的植株的開花時間，兩者之間呈極顯著差異（P<0.01）（圖6）。該InDel標記基因型和開花時間表型的Pearson相關性分析表明，材料開花時間的早晚與基因型呈極顯著相關（r=0.991，P<0.01）。表明CCA1基因的第727至第732個堿基的變異（A05：472204-472209）與開花時間呈極顯著相關，會影響植株的開花時間，可以為白菜類作物光周期影響開花時間的研究提供理論依據。同時，該位點可以作為功能分子標記進行輔助育種工作，加快育種進程。

2.5?CCA1基因的亞細胞定位分析

利用亞細胞定位在線預測軟件WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/psort.html）對CCA1基因在細胞中表達的位置進行預測，顯示CCA1基因有91.3%的可能性定位在細胞核上。而通過在洋蔥表皮中進行的亞細胞定位試驗（圖7）發現，在陽性對照中，細胞膜、細胞質和細胞核上都能觀察到綠色熒光?而來源YS-143的CCA1蛋白的熒光信號主要集中在細胞核上，說明CCA1基因主要在細胞核上發揮功能。

3?討論與結論

在光周期條件下，白菜類作物具有不同的敏感性反應。張學銘對100份白菜類作物抽薹開花性狀的光周期敏感性進行調查，發現具有較大差異[3]。本研究所用材料YS-143在長日照條件下平均開花時間為（48±10） d，短日照條件下為（96±10） d;VT-044在長日照條件下平均開花時間為（105±15） d，短日照條件下在統計時間內沒有開花。因此，選取的YS-143和VT-044均為光周期敏感類型，可以作為試驗材料進行光周期變化對開花時間影響的研究。

研究者分別從楊樹、大麥、玉米等植物中克隆到了相應的CCA1基因，分子進化關系表明，它們之間氨基酸序列的同源性較高，且在單、雙子葉植物間非常保守，其N端的核酸結構域的氨基酸序列相似度高達79%以上[17-19]。這與本研究結果類似，筆者也發現2個材料與大白菜、甘藍型油菜、蘿卜的基因序列具有較高同源性，與擬南芥、亞麻芥的進化距離也較近，其中N端的核酸結構域的氨基酸序列相似度接近100%。Yi等對來自3個蕪菁自交系（RCBr、Kenshin、Chiifu）的CCA1基因序列進行了分析，在第4內含子上鑒定出高水平的序列變異，并據此開發出1個InDel標記，進而分別用PCR及HRM（high-resolution melting）技術2種方法對其進行驗證，均證明該第4內含子上的序列變異可以作為InDel分子標記參[CM（25]與蕪菁的育種工作[12]。張志剛等在2個大白菜品種上克隆CCA1基因的cDNA序列，分別在329 bp（第4外顯子）處和第1 407 bp（第7外顯子）處開發出2個InDel分子標記，并利用PCR法進行了驗證[13]。本研究選擇更有可能對植物表型造成影響的外顯子序列進行分析，將分別在第330 bp（第4外顯子）、第726 bp（第6外顯子）、第789 bp（第6外顯子）和第1 515 bp（第7外顯子）處鑒定到的4段序列差異與F2代分離群體的開花時間進行關聯分析，發現位于第726 bp處的序列差異與開花時間相關，其余3段不相關。其中第4外顯子上的序列差異與張志剛等鑒定到的序列[13]位置相近、序列相同。同時筆者也發現，F2群體中基因型為ACCCTT/ACCCTT的植株的開花時間并不是都早于基因型為-/-的植株。其主要原因可能是開花時間并不只受CCA1基因控制，而是受多個開花時間相關基因和多條路徑相互協調、共同調控的。在擬南芥中，發現CCA1基因定位在細胞核上[20]。本研究通過亞細胞定位試驗發現，不結球白菜YS-143中的CCA1基因在細胞核上表達，表明在擬南芥到白菜類作物進化過程中，CCA1基因依然在細胞核中發揮原有的作用。

已有研究指出，在現代育種中改良某個特定的優良性狀最有效的途徑就是選擇攜帶某一性狀的目的基因的供體親本進行回交，同時利用各種分子標記進行輔助選擇，迅速地將與分子標記連鎖的基因轉移到另外一個品種上，從而顯著加速育種年限[21]。本研究關于CCA1基因功能標記的開發與利用，可為白菜類作物分子標記輔助育種提供一定的理論依據和現實意義，為開發通用的白菜類作物InDel標記提供了重要的一步。

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