瑞芬太尼對膿毒癥大鼠急性肺損傷保護作用的實驗研究

張貝蕾 廖秀玉▲ 林建東 劉名法 吳 越 楊閩霞

1.福建醫科大學附屬第一醫院重癥醫學科，福建福州 350005；2.福州長樂區醫院內科，福建福州 350200

急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）在膿毒癥中非常常見，也是導致重癥監護室患者死亡的首要原因。瑞芬太尼是一種μ 受體激動劑，目前被廣泛使用在ICU 危重患者的鎮靜鎮痛治療中，研究發現在膿毒癥時，瑞芬太尼有著抗炎的作用，但是其具體機制尚不清楚。本文擬通過ELISA 測定膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6 水平并測定肺組織氧化應激指標SOD 活性及MDA 的水平，以闡明瑞芬太尼對膿毒癥急性肺損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

雄性清潔級Wistar 大鼠32 只，體質量270 ～320g，上海斯萊克實驗動物有限公司。瑞芬太尼（規格：1mg，江蘇恒瑞制藥廠，H20030197），烏拉坦Urethane（Sigma-Aldrich），TNF-α 和IL-6 測試盒（solarbio 有限公司），MDA 和SOD 測試盒（南京建成生物工程研究所），脂多糖LPS（Escherichia coli O127：B8,Sigma，St. Quentin Fallavier，France）。

1.2 動物分組和模型制備

大鼠按隨機數字表法分為四組，即對照組、ALI組、瑞芬太尼處理組、瑞芬太尼對照組（每組8 只）。采用LPS 誘導制備膿毒癥急性肺損傷模型，大鼠常規禁食6h，不禁飲。烏拉坦腹腔注射誘導麻醉大鼠，將其放置于變溫毯上俯臥，維持體溫（36±0.1）℃。除烏拉坦經腹腔注射外，瑞芬太尼和LPS 均通過尾靜脈注射。具體給藥方式如下：ALI 組給予LPS 15mg/kg 尾靜脈注射（20min 注射完畢），對照組用相同量的生理鹽水代替；瑞芬太尼處理組，首先注射LPS 15mg/kg，20min 后給予瑞芬太尼（0.04mg/kg），40min 注射完畢。瑞芬太尼對照組先給予與LPS 等量生理鹽注射，20min 后再給予瑞芬太尼（0.04mg/kg）40min 注射完畢。所有組予生理鹽水液體復蘇，總補液量為5mL/h，在2h 內注射完畢。

1.3 標本的留取

造模成功6h 后打開胸腔，取右肺上葉，用濾紙吸干肺表面的水分，稱濕重后，恒溫干燥箱85℃烘烤48h，稱干重，計算W/D。右肺部分組織，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，行HE 染色，光鏡下進行組織病理學評估；右肺部分組織，-80℃低溫冰箱保存，用于EILSA 檢測TNF-α、IL-6 的水平及MPO、SOD 檢測。

1.4 TNF-α、IL-6、MDA和SOD檢測

采用酶聯免疫分析法（ELISA）檢測TNF-α和IL-6，具體按照操作試劑盒說明書進行。采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD 的含量和活性，用硫代巴比妥酶法測定MDA 的含量，具體按照操作試劑盒說明書進行，肺組織中的SOD、MDA 含量按照公式計算，考馬斯亮藍檢測蛋白含量。

1.5 統計學方法

采用統計學軟件SPSS18.0 對數據進行統計分析，計量資料以（s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺組織TNF-α和IL-6的表達

LPS 注 射 后6h，LPS 致ALI 組 大 鼠 肺 組 織 中TNF-α 和IL-6 水平顯著高于對照組（P 均＜0.05），而瑞芬太尼處理組大鼠的TNF-α 和IL-6 平顯著低于ALI 組（P 均＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠肺組織TNF-α和IL-6的水平 s，pg/mL）

表1 各組大鼠肺組織TNF-α和IL-6的水平 s，pg/mL）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與ALI 組比較，#P ＜0.05

2.2 大鼠肺組織SOD、MDA水平

與對照組相比，ALI 組肺干濕比明顯升高，肺組織勻漿MDA 水平升高，而SOD 水平顯著降低（P 均＜0.05），提示LPS 導致肺組織水腫，肺部受氧自由基攻擊的嚴重程度增加，而清除氧自由基的能力減弱。與ALI 組相比，瑞芬太尼處理組大鼠肺濕干比重、肺組織勻漿MDA 水平顯著降低，SOD 水平則顯著升高（P 均＜0.05），提示瑞芬太尼可以改善膿毒癥ALI 肺組織的抗氧化能力。見表2。

表2 各組大鼠肺濕干比重和肺組織MDA、SOD的水平

表2 各組大鼠肺濕干比重和肺組織MDA、SOD的水平

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與ALI 組比較，#P ＜0.05

2.3 病理學改變

肺臟的病理損傷輕重分度參照等SU 的方法評判。由兩位病理科醫師對每張切片隨機選擇在高倍視野進行觀察。顯微鏡下急性肺損傷定義為中性粒細胞浸潤、間質水腫、出血、透明膜形成、壞死和充血。肺損傷嚴重度評分標準：（1）正常；（2）極輕度（＜25%）;（3）輕度（25%～49%）;（4）中度（50%～75%）；（5）重度（＞75%）。根據上述標準進行肺臟病理學評分，兩位醫師采用雙盲法的評分結果計算平均分后作為大鼠肺部損傷的病理評分。

ALI 組大鼠的肺組織體積増大，色澤暗紅甚至發黑，可有淡紅色血性液體滲出。肺組織石蠟切片HE 染色光鏡顯示（圖1 ～4），對照組大鼠肺組織結構完整，形態正常，肺泡腔清晰，腔內無滲液，肺泡壁光滑,肺泡和肺間質無炎癥細胞浸潤。ALI 組肺組織結構損傷嚴重，肺泡隔增寬，肺泡膨脹不全，部分塌陷或有肺泡融合，無法辨別肺泡結構，可見大量炎性細胞聚集，毛細血管擴張充血，管腔內可見大量紅細胞。而瑞芬太尼處理組大鼠的肺組織上述病理學改變則明顯減輕。

圖1 對照組肺組織病理學（HE 染色×400 倍）

圖2 瑞芬太尼對照組肺組織病理學（HE 染色×400 倍）

圖3 瑞芬太尼處理組肺組織病理學（HE 染色×400 倍）

圖4 ALI 組肺組織病理學（HE 染色×400 倍）

3 討論

在膿毒癥發展到全身臟器功能衰竭綜合征（MODS）的過程中，肺經常是第一個受到累及的臟器[1-2]。膿毒癥相關的ALI/ARDS 起病迅速且極其危重，是膿毒癥發病率和死亡率最高的臨床綜合征[3]。超過50%的膿毒癥為革蘭氏陰性菌引起的,內毒素是構成革蘭氏陰性桿菌外膜的主要成分，能夠觸發一系列瀑布式級聯炎癥反應，導致機體產生大量的促炎細胞因子,具有極強的誘導膿毒癥的能力。LPS 誘導的膿毒癥模型是公認的與臨床相關性較強的膿毒癥模型，廣泛用于膿毒癥發病機制的研究。本研究通過靜脈注射LPS 誘導大鼠產生膿毒癥急性肺損傷，發現ALI 組大鼠肺組織結構損傷嚴重，肺泡隔增寬，肺泡膨脹不全，部分塌陷或有肺泡融合，可見大量炎性細胞聚集。符合ALI 的病理學改變，而瑞芬太尼處理組大鼠的肺組織上述病理學改變則相對減輕。肺泡結構破壞可見少量破壞，大部分結構完整，肺間質僅見輕微水腫，肺泡腔內及間質中紅細胞的滲出及炎性細胞的浸潤均較ALI 組輕。

ALI 的發病機制尚未完全闡明，目前認為全身炎癥反應在ALI/ARDS 的發生和發展中起關鍵作用[4-7]。內毒素通過活化巨噬細胞及單核細胞，導致瀑布式的炎癥級聯反應，產生并釋放大量的炎癥介質如白細胞介素、TNF-α,導致肺泡上皮細胞和肺毛細血管上皮細胞損傷，肺血屏障功能障礙，最終導致間質性水腫與肺泡性水腫，以及肺泡內透明膜形成，從而導致膿毒癥發展成ALI/ARDS。在ALI的發展過程中最主要的炎癥細胞因子包括TNF-α和IL-6[8]。TNF-α 是介導內毒素休克、全身的炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、ARDS 和多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的重要起始因子[9-10]，其能導致通過使溶酶體受損導致酶外泄、刺激血管內皮細胞、上調肺血管內皮細胞間粘附分子-1、促使白細胞遷移至炎癥部位、誘導內皮細胞和巨噬細胞合成、釋放IL-1、IL-6、IL-8、釋放過氧化物和溶酶體,促進炎癥反應、促進花生四烯酸的代謝和脂類介質的產生,促進微血栓形成等多種途徑導致肺損傷[11-13]。IL-6 也是一種重要的致炎炎癥因子，在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征患者肺部和血液中大量分泌，含量明顯高于健康人，能夠反應肺組織的損傷程度。IL-6 參與巨噬細胞的分化和浸潤，能夠通過激活補體及C 反應蛋白的表達,誘導產生黏附分子,激活血管內皮細胞及淋巴細胞，參與時肺損傷的急性期反應[14-15]。因此抑制細胞因的產生是治療炎癥性疾病的有效手段。本研究表明LPS 可以導致TNF-α 和IL-6 水平顯著升高，而瑞芬太尼能夠通過增加顯著降低促炎因子TNF-α和IL-6 的水平，減輕膿毒癥誘導的ALI。

在膿毒癥的發病及發展過程中，氧自由基所導致的氧化還原損傷是造成肺泡結構破壞和功能障礙的重要原因。在ALI/ARDS 的發病機制中機體特別是肺內的氧化/抗氧化平衡失調起主要作用[16-18]。膿毒癥時大量氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,引發脂質過氧化從而形成大量脂質過氧化產物MDA，MDA 是脂質過氧化物的一種，是氧化應激和抗氧化劑狀態的標志物，MDA 的量可以反應機體受氧自由基攻擊的嚴重程度。而SOD 是生物體內氧自由基的天然清除劑，能清除體內超氧陰離子、自由基保護細胞免受損傷, SOD 的高低可以間接反映機體清除氧自由基的能力,對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用。SOD 和MDA 聯合檢測能很好反應氧化應激狀態,能夠代表組織損傷程度[9]。本研究發現，與對照組相比ALI 組MDA顯著增加而SOD 下降，提示LPS 導致肺組織產生氧化應激損傷。而瑞芬太尼能夠上調SOD 并且降低MDA 的含量，提示瑞芬太尼可以通過減少氧自由基的產生并提高機體的抗氧化能力，抑制LPS 導致的氧化應激損傷，對ALI 有保護作用。

綜上所述，瑞芬太尼能夠通過減少抗炎細胞因子的的表達，并通過抗氧化應激途徑對LPS 導致的ALI 起到保護作用。