附子理中湯治療胃潰瘍的藥效機制探討

黃家望，謝希，陳平安，袁娉，廖燦，劉俊杰，李玲*

(1.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208； 2.湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學中醫學院，湖南 長沙 410208; 4.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208)

胃潰瘍主要是指胃黏膜被胃消化液自身消化造成的超過黏膜肌層的組織損傷，是發生于賁門與幽門之間的炎性壞死病變，是消化性潰瘍中最常見的一種，其表現為中央部位炎性壞死和典型水腫[1]。其主要機制與水液代謝的動態平衡密切相關。無水乙醇等化學因素所致的急性胃損傷模型伴有細胞內外特征性水腫反應[2-3]。AQP1、AQP3、AQP4可通過促進細胞連接的動態調節對傷口進行修復[4]，是人體胃組織中主要表達的水通道蛋白[5]。附子理中湯由附子、人參、干姜、甘草、白術組成。附子理中湯在臨床主要用于“脾陽虛”等相關疾病的治療，但未見其對胃潰瘍藥效機制研究。實驗過程中我們發現，模型組潰瘍周圍見水腫，正常對照組大鼠未出現水腫，而附子理中湯水煎液灌胃后能顯著改善大鼠胃潰瘍水腫。基于此，推測附子理中湯抗胃潰瘍的作用機制可能與調節水液代謝平衡相關。因此，本實驗擬在前期研究的基礎上，進一步研究附子理中湯對大鼠水通道蛋白基因表達的影響，從水液代謝途徑探討附子理中湯抗食醋誘導的胃潰瘍的作用機制。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

臺式高速冷凍離心機(美國Thermo)，凈化工作臺(吳江凈化，YJ-875A)，超微量分光光度計(德國IMPLEN)，實時定量PCR儀(美國Bio-RadFX Connect)，微量移液器(德國eppendorf)、石蠟切片機(美國A0820)。

1.2 主要試劑

1.2.1 糯米白醋

萊陽魯花醋業食品有限公司生產，生產日期為2018年5月28日，保質期24個月，食品生產許可證編號為SC10337068208749。

RT-PCR檢測相關試劑Trizol(Invitrogen)，逆轉錄試劑盒(promega，A3500)，qPCR mix(promega,A6001)，AQP1、AQP3、AQP4引物(生工)。

1.3 實驗動物

200 g左右SD雄性大鼠20只，由斯萊克景達動物公司提供，動物質量合格證號SYXK(湘)2013-0005。

1.4 實驗藥品

藥物均購自湖南中醫藥大學附屬第一醫院，按動物體表面積劑量換算法，用雙蒸餾水制備大鼠臨床等效劑量的各藥物水溶液。見表1。

表1 藥物說明及小鼠臨床等效用量

2 研究方法

2.1 食醋干預大鼠胃潰瘍模型建立與實驗分組干預

將大鼠隨機分為空白組和食醋灌胃組，禁食4 h、禁水1 h后，以食醋灌胃建模，1.5 mL/(100 g·d)，連續灌胃5 d，灌胃后1 h恢復飲食飲水，食醋造模最后一天灌胃完后將食醋灌胃組隨機分為空白組、模型組、雷尼替丁組、附子理中湯組。

表2 實驗分組與干預方式

2.2 指標檢測

2.2.1 一般情況

末次給藥后，大鼠禁水禁食8 h，處理動物。常規記錄大鼠一般情況和體質量，分離脾臟、胃臟并稱重。

2.2.2 HE染色法觀察大鼠胃腸組織病理變化

選取大鼠病變區胃組織和十二指腸，10%中性甲醛固定、梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，間斷連續5 μm厚切片，HE染色、脫水、透明、封片。光學顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

2.2.3 RT-PCR法檢測胃組織AQP1、AQP3、AQP4基因的表達

取胃組織，Trizol法提取各組肺組織總RNA，超微量紫外分光光度計檢測濃度后將1 μg總RNA逆轉錄合成cDNA，以此cDNA為模板用熒光定量PCR試劑盒進行擴增。實驗操作均按相應試劑盒說明書進行。qPCR反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，循環40次。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算各組AQP1、AQP3、AQP4相對表達量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表3。

表3 引物序列

2.3 統計分析

3 結果

3.1 附子理中湯對胃潰瘍大鼠一般情況的影響

如圖1所示：空白組大鼠精神良好，毛發有光澤，活動、進食、排便正常，體質量飲食自然增加；模型組出現豎毛、毛色缺乏光澤、弓背、蜷臥、活動減少、便溏，肛周污穢，體質量飲食下降，胃指數、脾指數下降，與空白組相比，差異顯著(P<0.05)；各藥物干預組均能不同程度的改善的一般情況，與模型組相比較，差異顯著(P<0.01、0.05)，干預效果為雷尼替丁稍優于附子理中湯，但兩組間差異無統計學意義。

3.2 附子理中湯對胃潰瘍大鼠胃腸組織病理變化的影響

如圖2所示：正常大鼠胃組織大體觀見胃黏膜及黏膜皺襞正常，未見糜爛、出血、潰瘍灶；模型組大鼠胃組織大體觀可見胃竇前壁食醋注射區形成圓形或橢圓形的深大潰瘍，邊緣整齊，狀如刀切，底部平坦，周圍糜爛充血水腫；各藥物組大體觀可見胃黏膜光整完好與正常無異，黏膜皺襞明顯，未見糜爛、出血水腫，可見潰瘍灶修復。

如圖3、4所示：正常大鼠顯微鏡下可見胃竇壁結構完整，明顯可見黏膜、黏膜下層分層，黏膜腺體排列整齊，無黏膜上皮破壞、脫落、出血、無炎性細胞浸潤，胞漿勻稱，無空泡及核固縮；模型組顯微鏡下可見胃竇壁結構明顯破壞，黏膜腺體消失，黏膜面表層見滲出物及壞死組織，其下為肉芽組織，并見大量炎性細胞浸潤，潰瘍周圍腺體胞漿有空泡，核固縮或細胞破裂，而間質見充血水腫及新生毛細血管出現；各藥物組顯微鏡下可見胃竇壁局部腺體排列紊亂，滲出物及壞死組織逐漸吸收、排出，已被破壞的肌層由底部肉芽組織增生形成瘢痕充填修復，未見明顯出血及炎性細胞浸潤。

如圖5、6所示：正常大鼠十二指腸可見腸黏膜和黏膜下層結構完整且連續，腸絨毛排列整齊，肌層正常，無黏膜上皮破壞、脫落、出血，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠腸黏膜和黏膜下層破壞且不連續，肌層受損，黏膜面表層見滲出物及壞死組織，其下為肉芽組織，炎性細胞浸潤，炎癥嚴重；各藥物組腸黏膜和黏膜下層開始修復且部分見連續，肌層由底部肉芽組織增生形成斑痕組織充填修復，炎癥滲出物逐漸吸收、排出，見腸絨毛增生。

3.3 附子理中湯對胃潰瘍大鼠AQP1、AQP3和AQP4基因表達的影響

如圖7所示：食醋灌胃干預后，胃組織中AQP1表達水平下降,AQP3、AQP4表達水平增加，與正常對照組比較，差異顯著(P<0.05)。藥物干預后各組大鼠胃組織中AQP1水平不同程度增加，AQP3、AQP4水平不同程度降低，與模型組比較，差異顯著(P<0.05)。干預效果為雷尼替丁優于附子理中湯。

圖1 各組大鼠體質量、飲食、胃指數、脾指數的比較

圖2 各組大鼠胃組織大體標本的比較

圖3 各組大鼠胃組織病理變化的比較(HE，×40)

圖4 各組大鼠胃組織病理變化的比較(HE，×100)

圖5 各組大鼠十二指腸病理變化的比較(HE，×40)

圖6 各組大鼠十二指腸病理變化的比較(HE，×100)

圖7 各組大鼠胃組織中AQP1、AQP3和AQP4mRNA表達的比較

4 討論

食醋灌胃干預后使得大鼠胃黏膜受損，使胃上皮細胞間的緊密連接處脂肪蛋白質、微循環等被破壞，胃的負擔加重或刺激過強，從而形成潰瘍[6]。潰瘍的發生與水液代謝的動態平衡密切相關。水通道蛋白(AQPs)是近年發現的介導水液跨膜轉運的一類膜蛋白[7-8]，在哺乳動物組織內廣泛分布，人體的胃組織中AQP1、AQP、3AQP4表達強烈[5]。有研究表明[9-11]，AQP1和AQP4在維持胃黏膜完整性方面起著重要作用，增強了胃對乙醇所致水腫的防御,AQP3在胃腺癌細胞中起著重要作用，參與幽門螺旋桿菌感染引發胃癌的過程。胃炎、胃潰瘍等胃腸道疾病的發生、發展和轉歸均與AQPs對水液代謝調節密切相關[12-13]。AQP1和AQP4還參與了乙醇和辣椒素致急性胃黏膜水腫和損傷的進程[2]。因此，水通道蛋白是藥物治療水液代謝平衡失調的重要作用靶點[14]。本研究結果證實AQP1、AQP3和AQP4在胃潰瘍的發病機制中有著重要作用，通過介導水液跨膜轉運，調節水液代謝的動態平衡，改善胃黏膜的潰瘍程度，起到治療作用，與潰瘍程度成負相關。

附子理中湯為《傷寒論》理中湯加大辛大熱之附子而成，是傳統的溫中名方。《傷寒論》中記載理中湯由附子、人參、干姜、白術和炙甘草組成；具有補虛回陽，溫中祛寒，補氣健脾的作用。方中附子和干姜具有抗潰瘍和鎮痛抗炎的作用，對溫里藥治療臍腹冷痛起到了加強作用；甘草、白術也都具有抗消化道潰瘍、抗炎鎮痛的藥理作用；且甘草解百毒，與附子、干姜同煮，可使附子毒性大減。諸藥合用，標本兼顧，脾腎雙補，溫中散寒，中陽建運，復使清陽上升，濁陰下降，清濁各行其道，故臨床療效顯著。現代藥理實驗研究證明[15]，附子理中湯能增強小鼠的耐寒能力，對醋酸引起的小鼠腹痛有顯著的鎮痛作用，同時還可顯著提高胃黏膜的SOD活性，降低MDA的含量，發揮其對胃黏膜保護作用，從而加速潰瘍愈合。

綜上所述，附子理中湯能顯著提高AQP1的表達,下調AQP3和AQP4的表達，表明附子理中湯抗食醋誘導的大鼠胃潰瘍的藥效機制可能是通過提高AQP1和下調AQP3、AQP4的表達，調節水液代謝動態平衡，介導水液跨膜轉運，進而起到保護胃黏膜的作用，最終改善大鼠胃組織潰瘍和水腫程度。但水液代謝平衡與AQP1、AQP3和AQP4是否為食醋誘導大鼠胃潰瘍的唯一機制還需進一步的機制研究，而附子理中湯的藥效成分復雜，作用靶點多樣，其抗食醋誘導的大鼠胃潰瘍的物質基礎需要進一步研究。